3.3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen VP1
Để khẳng đi ̣nh mô ̣t cách chắc chắn sản phẩm phả n ứng RT -PCR chính là gen VP1 của virus LMLM , chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định trình tự DNA của
các sản phẩm này . Ngoài ra, sản phẩm RT -PCR là toàn bô ̣ gen VP1, do đó viê ̣c lưu giữ các gen này là rất cần thiết để làm nguyên liê ̣u cho viê ̣c sản xuất vaccine thế hê ̣ mới hoă ̣c các ứng dụng khác sau này . Sản phẩm RT -PCR từ mẫu bệnh phẩm trên đươ ̣c gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen). Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector mang sản phẩm RT -PCR gen mã hóa protein VP 1 của virus LMLM. Vector tái tổ hơ ̣p thu đươ ̣c từ phản ứng gắn trên đươ ̣c biến na ̣p vào tế bào E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiê ̣t . Cấy trải thể biến na ̣p trên môi trường LB đă ̣c có bổ sung Amp , X-gal và IPTG , sau đó nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Trên môi trường này , khuẩn la ̣c mang vector tái tổ hợp chứa gen VP1 sẽ có màu trắng, còn khuẩn lạc mang vector pCR 2.1 tự đóng vòng không mang gen ngoa ̣i lai sẽ có màu xanh ( Hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. colichủng DH5α
Những khuẩn la ̣c có màu xanh là do vector pCR 2.1 mang gen lac-Z hoạt đô ̣ng bình thường tạo ra enzyme β-galactosidse chuyển hóa X -gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc màu trắng là do nhận đượ c plasmid tái tổ hơ ̣p mang gen
lac-Z không hoạt đô ̣ng, do đoa ̣n DNA ngoa ̣i lai xen vào giữa lac promoter và gen cấu trúc lac-Z của operon Lac . Trong trường hợp này, lac promoter không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã nên không có sự dịch mã thành enzyme β-galactosidasa để phân hủy cơ chất X-gal do đó khuẩn la ̣c có màu trắng.
Để cho ̣n được các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen VP1, chúng tôi nhặ t mô ̣t số khuẩn la ̣c trắng và mô ̣t khuẩn la ̣c xanh (làm đối chứng) nuôi cấy trong môi trườ ng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp qua đêm, sau đó tách chiế t plasmid từ các tế bào đó và kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel agarose 1%. Trong quá trình điê ̣n di, phân tử DNA nào có kích thước càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh trong điê ̣n trường , ngược lại phân tử DNA có ích thước lớn thì di chuyển chậm hơn . Từ kết quả điê ̣n di kiểm tra ta thấy hầu hết các DNA plasmid tách từ khuẩn la ̣c trắng có kích thước lớn hơn DNA plasmid tá ch từ khuẩn la ̣c xanh . Điều này có khả năng do các plasmid tách từ
M 1 2 3 4 5
khuẩn lạc màu trắng có g ắn thêm sản phẩm RT-PCR nên kích thước lớn hơn DNA plasmid gốc. Tiếp theo chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra các DNA plasmid này bằng enzym giớ i ha ̣n.
Do vector tách dòng s ử dụng trong nghiên cứu có 2 vị trí cắt của enzyme
EcoRI ở 2 đầu của vùng cắt g ắn đa vi ̣, vị trí gắn của DNA ngoại lai , nên nếu các dòng DNA plasmid có gắn sản phẩm RT -PCR thì sau khi xử lý bằng enzym này sẽ văng ra 1 đoa ̣n DNA có chiều dài tương đương với chiều dài sản phẩm RT -PCR gắn vào . Bằng phương pháp này chúng tôi đã cho ̣n được cả 10 dòng plasmid tái tổ hơ ̣p mang sản phẩm RT -PCR gen VP1 khuếch đa ̣i từ 10 mẫu bê ̣nh phẩm trong nghiên cứu (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di các dòng DNA plasmid tái tổ hơ ̣p sau khi x ử lý bằng EcoRI. Đường chạy M: thang DNA chuẩn, Đường chạy 1-5: plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm RT-PCR từ các mẫu bê ̣nh phẩm từ số 1-5 cắt với E.coR I.
Tiếp theo chúng tôi tiến hành giải trình tự các dòng plasmid tái tổ hợp thu được ở trên và so sánh với các trình tự gen VP1 đã được công bố trên Genbank.
3.3.2 Giải trình tự gen mã hóa protein VP1
Vì ch ất lượng của phản ứng xác định trình tự phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh sạch của mẫu DNA plasmid . Do đó trước khi tiến hành quá trình giải trình tự , chúng tôi tiến hành tinh sa ̣ch các dòng DNA plasmid đã phân tích bằng enzyme EcoRI trên bằng S.N.A.P miniprep Kit (Invitrogen). Kết quả tinh s ạch được kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel agarose 1% và đo OD ở bước sóng 260 và 280 nm. Kết quả đo OD đều cho kết quả A260/A280 đều trên 1.8 (kết quả không trình bày ở đây ). Như vậy DNA plasmid có độ tinh sạch cao, đảm bảo cho việc xác định trình tự DNA.
Các plasmid này sau đó được xác định trình tự DNA trên máy xác định trình tự DNA tự đô ̣ng ABI prism 3100 Sequenser ( Applied Biosytems ) với bô ̣ kit xác đi ̣nh trình tự BigD ye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit củ a hãng Applied Biosytems. Quá trình giải trình tự được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu .
Sau khi giải trình tự, trình tự gen được phân tích bằng phần mềm Bioedit và BLAST. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen vừa tách dòng với các gen đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Kết quả so sánh trình tự cho thấy, gen VP1 được tách dòng từ 10 mẫu bệnh phẩm đều là gen mã hóa protein VP1 của virus LMLM type O , đồng thời khẳng đi ̣nh chúng tôi đã tách dòng thành công gen mã hóa protein VP 1 của các chủng virus LMLM lưu hành tại Việt Nam.
So sánh trình tự gen VP1vừa tách dòng từ 10 mẫu bê ̣nh phẩm virus LMLM phân lập ở các đ ịa phương khác nhau ở Việt Nam năm 2010 (Bảng 2.1) cho thấy chúng hoàn toàn giống nhau. Phân tích sâu hơn chúng tôi nhâ ̣n thấy, gen VP1 thuộc type O phân lập từ gia súc ở Việt Nam năm 2010 có độ tương đồng gần cao (99- 100%) so với gen VP1 của cùng type lưu hành trong nước năm 2009. Điều đó cho thấy virus type O lưu hành trong nước hiện chưa có biến đổi so với chủng gây bệnh năm 2009. So với các chủng virus cùng type lưu hành ở các nước trong khu vực cũng cho kết quả tương tự. Chủng virus LMLM type O lưu hành tại Việt Nam năm 2010 có độ tương đồng rất cao so với các chủng lưu hành ở Myanma, Đài Loàn, Lào từ năm 2009-2010. Tuy nhiên so với các chủng lưu hành trước năm 2009 thì đã có sự biến đổi khá lớn, mức độ tương đồng từ 91-96%.
Tuy nhiên khi so sánh với trình tự gen VP1 từ chủng virus LMLM type O g ây dịch bệnh trong nước vào năm 2006 (mã số GU582108.1), chúng tôi nhận thấy chúng có sự biến đổi rất lớn. Độ tương đồng trình chỉ đạt 90,4 % và 94,3% tương ứng ở mức độ gen và mức đô ̣ protein . Kết quả nghiên cứu này gợi ý rằng cần có những nghiên cứu sâu hơn về các chúng virus LMLM đang lưu hành trong nước để từ đó có chiến lược sản xuất và sử dụng vaccine trong nước phù hợp , vì nếu vaccine đang dùng được phát triển trên cơ sở các chủng virus LMLM gây đại dich từ nhiều năm trước có thể không có hoặc có công hiệu phòng vệ kém với các chủng virus hiện đang lưu hành.
3.4 Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loa ̣i
Phân tích tiếp dựa trên cây phát sinh chủng loa ̣i (Hình 3.7) cho thấy, các type virus LMLM nghiên cứu có đ ộ tương đồng di truyền gần với các chủng virus ở Lào, Hongkong, Myanma và Malaysia từ năm 2008 trở lại đây. Đối với các chủng virus từ năm 2008 trở về trước hoặc có khoảng cách xa v ề mặt địa lý như Ai Cập, Israel,…mức độ tương đồng có khoảng cách khá xa so với các ch ủng virus trong nghiên cứu này. Phân tích cây phả hê ̣ dựa trên trình tự gen VP 1 còn cho thấy, tất cả các virus LMLM type O trong nghiên cứu đều thuộc nhóm SEA (South East Asia).
Hình 3.7. Cây phát sinh dựa trên trình tự gen VP1 của virus LMLM so sánh mối quan hệ giữa type O phân lập ở Việt Nam và các type virus LMLM khác trên thế giới. Phân tích dựa trên phương pháp neighbor-joining với giá trị lấy mẫu bootstrap là 1000, chỉ có giá trị trên 60% được đưa ra. ● Các chủng thu nhận tại Việt Nam được phân tích trong bài báo.
Như chúng ta đã biết, sự biến đổi kháng nguyên trong một type huyết thanh là một cơ chế để virus thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ. Trong số 7 type huyết thanh virus LMLM, type A và type O có tính kháng nguyên và di truyền đa dạng nhất, khó kiểm soát bằng cách tiêm chủng vaccine [27, 30, 44]. Protein vỏ VP1 được nghiên cứu nhiều nhất bởi vai trò của chúng trong sự lây nhi ễm của virus và ch ống lại hệ miễn dịch củ a vâ ̣t chủ [11,26].
Nghiên cứu dịch tễ học và phân tử của các chủng virus LMLM là quan trọng và rất hữu ích trong việc theo dõi sự tiến hóa và nguồn gốc của virus và phát triển các kit chẩn đoán và vaccine phòng vệ [19]. Dựa vào những k ết quả thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi gơ ̣i ý c ần lựa chọn các loại vaccine có nguồn gốc gần với các chủng như O/MOG/7/2010; O/MYA/12/2009; O/MAY/21/2009; O/HONGKONG/P424/2011. Việc các virus thuộc type O có khoảng cách di truyền xa so với virus type A (Hình 3.7) cũng là minh chứng cho thấy các type virus LMLM không có tính miễn di ̣ch chéo.
KẾT LUẬN
1.Đã xây dựng thành công kỹ th uâ ̣t RT-PCR phát hiện nhanh virus LMLM và áp du ̣ng trên 10 mẫu bê ̣nh phẩm thu thập từ trâu, bò ở mô ̣t số tỉnh miền Bắc Việt Nam năm 2010. Kết quả cho thấy cả 10 mẫu bệnh phẩm dươ ng tính với virus LMLM.
2.Đã khuếch đa ̣i, tách dòng và xác định trình tự trọn vẹn gen VP1của 10 mẫu dương tính với virus LMLM và đăng ký trong Genbank.
3.Đã xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen VP1 của 10 mẫu virus LMLM phát hiện trong nghiên cứu kết hợp với các trình tự gen tương ứng khai thác từ GenBank. Kết quả phân tích cho th ấy, 10 chủng virus LMLM nêu trên thuô ̣c type O, nhóm SEA (South East Asia) .
KIẾN NGHI ̣
- Tiếp tu ̣c thử nghiê ̣m trên các mẫu thực đi ̣a với số lượng mẫu nhiều hơn và với các type virus LMLM khác để tối ưu và hoàn thiện bộ kit chẩn đoán virus LMLM.
- Tiếp tu ̣c nghiên cứu phát triển được bô ̣ kit để vừa chẩn đoán đồng thời đi ̣nh type virus LMLM.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đào Trọng Đạt., 2000. Góp phần vào việc đấu tranh phòng chống bệnh lở mồm long móng – Tạp chí KHKT thỳ y, tập VII, số 3- số chuyên đề về bệnh lở mồm long móng. 6-7.
2. Nguyễn Tiến Dũng., 2000. (Bộ môm virus, viện thú y) bệnh lở mồm long móng (Bài tổng hợp) – Tạp chí KHKT thú y, tập VII, số chuyên đề về bệnh lở mồm long móng (tr8-17).
3. Nguyễn Vĩnh Phước (1970) một số đặc điểm dịch tễ học LMLM trâu, bò và biệm pháp phòng trị, (tr17-25).
4. Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Như Thanh, 2001. Giáo trình vi sinh vật đại cương. NXB Nông nghiệp.
Tiếng Anh
6. Agol, V.I., A. V. Pau, and E. Wimmer. 1999. Paradoxes of the replicaiton of picornaviral genome. Virus Res. 62: 129-147.
7. Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A.I., Garland, A.J.M., 2003, The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. J. Comp. Pathol. 129, 1-36. 8. Bastos, A.D.S., Boshoff, C.I., Keet, D.F., Bengis, R.G. and Thomson, G.R.
2000. Natural transmission of foot-and-mouth disease virus between African buffalo (Syncerus caffer) and impal (Aepyceros melampus) in the Kruger National Park, South Africa. Epid. Infect. 124: 591-598.
9. Bronsvoort, B.M., Radford, A.D., Tanya, V.N., Nfon, C., Kitching, R.P. and Morgan, K.L. 2004. Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease viruses in the Adamawa provine of Cameroon. J. Clin. Microbiol. 42: 2186-2196.
10.Carrillo, C., Tulman, E.R., Delhon, G., Lu, Z., Carreno, A., Vagnozzi, a., Kutish, G.F., Rock, D.L., 2005. Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. 79, 6487-6504.
11.Casas Olascoaga, R., 1978. Summary of current reseache of Pan American foot-and-mouth disease center on oil adjuvanted vaccine . Bull. Off. Int. Epiz. 89 (11-12), 1015-1054.
12.Casas Olascoage, R., 1984. Foot-and-mouth disease policies and control strategies in South America. Prev. Vet. Med. 2 (2), 341-352.
13.Casas Olacoaga, R., Gomes, I., Rosenberg, F.J., Auge de Mello, P., Astudillo, Vicente., Magallanes, N., 1999. Fiebre Aftosa, Book i-xv 1-458 Editora Atheneu, Sao Paulo.
14. Correa Melo, E., Saravia, V., Astudillo, V., 2002. Review of the status of foot- and-mouth disease in countries of South America and approaches to control and eradication. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 21 (3), 429-436.
15.DEFRA. 2005. International Animal Health Division. Foot and Mouth Disease Virus type Asia 1 in Central and East Asia. An update and commentary.
16.Domanski, R., Fitko, R., 1959. Disturrbances of the pituitary and other hormonal glands in cows after foot-and-mouth disease. Proceeding of the 16th International Veterinary Congress, Madrid, pp. 421.
17.Feng, Q., Chen, X., Ma, O., Liu, Y., Ding, M., Collins, R.A., Ko, L.S., Xing, J., Lau, L.T., Yu, A.C., Chen, J. Serotype and VP1 gene sequence of a foot-and- mouth disease virus from Hong Kong (2002). Biochem. Biophys. Res. Commun. 302, (2003) 715–721.
18.Fogeby, E. Review of epizootiology and control of foot-and-mouth disease in Europe, 1937-1961. Eur. Comm. Control of FMD, FAO, Rome, 1963.
19.Giridharan, P., Hemadri, D., Tosh, C., Sanyal, A. and Bandyopadhyay, S.K., 2005. Development and evaluation of a multiplex PCR for differentiation of foot-and mouth disease virus strains native to India. J Virol Methods 126, 1-11.
20.Gleeson, L.J., 2002, A review of the status of foot-and-moụt disease in South- East Asia and approaches to control and eradication. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz 21, 465-475.
21.Gleeson, L.J., Samuel, A.R., Knowles, N.J., 2003. Epidemiology of foot-and- mouth disease in Southeast Asia. In: International symposium: Foot-and- mouth disease control strategies, Lyons, France, pp. 85-96.
22.Hoang, V.N., 2009. In: 15th Meeting of the OIE Sub-Commission for Foot and Mouth Disease in South-East Asia, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia, 9–13 March.
23.Hoffmann, B., Beer, M., Reid, S.M., Mertens, P., Oura, C.A., van Rijn, P.A., Slomka, M.J., Banks, J., Brown, I.H., Alexander, D.J. and King, D.P., 2009. A review of RT-PCR technologies used in veterinary virology and disease control: sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organisation for Animal Health. Vet Microbiol 139, 1-23.
24.Jackson, T., A.M.Q.King, D.I. Stuart, and E. Fry. 2003. Structure and receptor binding. Virus Res. 91:33-46.
25.Jangra, R.K., Tosh, C., Sanyal, A., Hemadri, D., Bandyopadhyay, S.K. Antigenic and genetic analyses of foot-and-mouth disease virus type A isolates for selection of candidate vaccine strain reveals emergence of a variant virus that is responsible for most recent outbreaks in India. Virus Res. 112, (2005) 52–59.
26.Kitching, R.P., 2005. Global epidemiology and prospects for control of foot- and-mouth disease. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 288, 133-148.
27.Khounsy, S., Conlan, J.V., Gleeson, L.J., Westbury, H.A., Colling, A., Paton, D.J., Ferris, N.P., Valarcher, J.F., Wadworth, J., Knowles, N.J., Blacksell, S.D., 2008, Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease viruses from South-east Asia 1996-2006: The Lao perspective. Vet. Microbiology.
28.Klein, J., Hussain, M., Ahmad, M., Normann, P., Afzal, M., Alexandersen, S. Genetic characterisation of the recent foot-and-mouth disease virus subtype A/IRN/2005. Virol. J. 4, (2007) 122.
29.Knowles, N.J., Samuel, A.R., Davies, P. R., Kitching, R.P. & Donaldson, A.I. (2001) outbreak of foot and mouth disease virus serotype) in the UK caused by a pandemic strain. Veterinary Record 148, 258-259.
30.Knowles, N.J., Samuel, A.R., 2003. Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus. Virus Res. 91, 65-80.
31.Knowles, N.J., Samuel, A.R., Davies, P.R., Kitching, R.P., Venkataramanan, R., Kanno, T., Scherbakov, A.V., Pacheco, J.M., Mason, P.W. 2000. Emergence of a pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O. In Session of the research group of the standing technical committee of the European Commission for the control of foot-and-mouth disease (Borovrts, Bulgaria, Rome, FAO), pp. 20-31.
32.Knowles, N.J., Davies, P.R., Henry, T., O’Donnell, V., Pacheco, J.M., Mason, P.W., 2001a, Emergence in Asia of foot-and-mouth disease viruses with altered host range: characterisation of alteration in the 3A protein. J. Virol. 75,