Că ̣p mồi chung VP1F và VP1R được thiết kế trên vùng bảo th ủ của gen VP 1. Theo thiết kế , cặp mồi này sẽ bám đă ̣c hiê ̣u vào gen VP1 của tất cả các type virus LMLM và cho sản phẩm PCR với kích thước 821bp (Phụ lục 3). Phản ứng RT-PCR với că ̣p mồi VP1F, VP1R được thực hiê ̣n với bô ̣ sinh phẩm OneStep RT -PCR (Bioneer, Hàn Quốc ) theo hướ ng dẫn của nhà sản xuất . Trong mỗi ống phản ứng đươ ̣c cung cấp bởi nhà sản xuất đã chứa đầy đủ các thành phần cần thiết cho phản ứng tạo cDNA và phản ứng PCR như : enzyme phiên mã ngươ ̣c , taq DNA polymerase, dNTPs, buffer. Bổ sung H20, cặp mồi VP1F-VP1R và 103
bản sao gen VP1 của 3 type (O, A, Asia1) virus LMLM chuẩn (3 type được xem là đang tồn ta ̣i ở Viê ̣t Nam) vào ống phản ứng trong tổng thể tích 25 µl. Cách tính số bản sao RNA đươ ̣c trình bày trong phần vâ ̣t liê ̣u và phương pháp nghiên cứu . Phản ứng được thực hiê ̣n với chương trình nhiê ̣t : 30 phút ở 42oC, sau đó là 35 chu kỳ (94oC – 40 giây, 52oC - 1 phút, 72oC – 1 phút) và cuối cùng 1chu kỳ ở 72oC – 10 phút. Mườ i microlit sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.1).
Hình 3.1. Kiểm tra tính đă ̣c hiê ̣u của că ̣p mồi chung VP1F,VP1R. M: DNA marker; 1,2,3 tương ứng với virus LMLM type A; virus LMLM type O; virus LMLM type Asia1.
Kết quả (Hình 3.1) cho thấy, sản phẩm PCR từ các m ẫu đều cho 1 băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 820bp đúng với kích thước gen mã hóa protein VP1 theo tính toán lý thuyết . Qua kết quả phân tích sản phẩm PCR có thể sơ bô ̣ kết luâ ̣n că ̣p mồi VP1F và VP1R khuếch đa ̣i đă ̣c hiê ̣u gen VP 1 của cả 3 type virus LMLM O , A và Asia1, không có sản phẩm phu ̣ do đó đáp ứng yêu cầu cho các nghiên cứu tiếp theo để ta ̣o bô ̣ kit chẩn đoán virus LMLM.
M 1 2 3 4 5 6
M 101 102 103 104 105 106 107 108 3.2.2 Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u và độ nhạy của phản ứng RT-PCR
Độ đặc hiệu
Với bất kỳ kỹ thuâ ̣t hay phương pháp chẩn đoán đoán nào , yếu tố quan trọng nhất đó là đô ̣ đă ̣c hiê ̣u và đô ̣ nhâ ̣y của phương pháp đó . Đối với gia súc như trâu , bò…thì việc đồng thời bi ̣ lây nhiễm bởi nhiều loa ̣i virus hoă ̣c vi khuẩn gây bê ̣nh khác nhau là hoàn toàn có thể . Do đó, các kỹ thuật chẩn đoán phải có độ đặc hiệu cao để không cho kết quả dương tinh hay âm tính giả . Phản ứng được tiế n hành với mẫu RNA của mô ̣t số virus khác (cúm A /H1N1; cúm A /H5N1, Bovine Viral Diarrhea Virus - BVDV) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng . Kết quả cho thấy phản ứng chỉ đă ̣c hiê ̣u với virus LMLM (Hình 3.2) và cho kết quả âm tính với các mẫu virus khác.
Hình 3.2. Thƣ̉ nghiê ̣m đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ƣ́ng RT-PCR
M: thang DNA; chứ ng dương 1, 2, 3: tương ứng với virus LMLM type A, O và Asia1; chứng âm 4: cúm A/H5N1; 5: cúm A/H1N1; 6: BVDV.
Độ nhạy
Phản ứng RT-PCR đươ ̣c thực hiê ̣n với các mẫu chuẩn có nồng đô ̣ khác nhau , từ 101 đến 108 bản sao RNA/µl và sử du ̣ng 10 µl để điê ̣n di trên gel agarose 2%. Kết quả điê ̣n di cho thấy phản ứng dương tính (quan sát được các va ̣ch DNA sau khi nhuô ̣m ethidium bromide) khi trong mẫu thử có từ 100 bản sao RNA trở lên (Hình 3.3).
Hình 3.3. Thử nghiê ̣m đánh giá đô ̣ nh ạy của phản ứng RT-PCR. Chú thích: M: thang DNA; 1-10: mẫu thử nghiê ̣m với số lượng bản sao RNA trong mẫu thử được ghi chú ở phía trên.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3.2.3 Phát hiện virus LMLM trong mẫu bê ̣nh phẩm
Ở Việt Nam , dịch bê ̣nh do virus LMLM vẫn đang xảy ra và có thể bùng phát bất cứ lúc nào . Do đó, viê ̣c xây dựng mô ̣t kỹ thuâ ̣t chẩn đoán nha nh và chính xác virus LMLM là hết sức cần thiết , góp phần phát hiện sớm khi có dịch xảy ra để có biê ̣n pháp xử lý di ̣ch ki ̣p thời . Để phát hiê ̣n virus LMLM người ta có thể ứng du ̣ng nhiều phương pháp khác nhau như : phản ứng lâm sàng, ELISA, phản ứng kết hợp bổ thể, Real-time RT-PCR,… Trong nghiên cứu này , phương pháp phát hiê ̣n virus LMLM trên cơ sở kỹ thuâ ̣t RT -PCR với că ̣p mồi đă ̣c h iê ̣u cho gen VP1 được xây dựng và tối ưu hóa . Điểm mới của phương ph áp này là phản ứng RT -PCR sử du ̣ng că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u cho phép phát hiê ̣n mo ̣i type virus LMLM , đồng thời sản phẩm RT- PCR có thể được giải trình tự cho các phân tích tiếp theo để xác đi ̣nh chính type /phân type virus. Các phương p háp của các tác giả khác trên thế giới đều dựa vào vùng không di ̣ch mã 5’-UTR và 3’-UTR. Đây là vùng có tính bảo thủ cao của virus LMLM, tuy nhiên kỹ thuâ ̣t này chỉ cho phép chẩn đoán mẫu có dương tính với virus LMLM hay không mà không thể xác đi ̣nh được type /phân type virus gây bê ̣nh. Đây là các thông tin vô cùng ý nghĩa cho viê ̣c điều tri ̣ cũng như cho viê ̣c nhâ ̣p khẩu hoă ̣c lựa cho ̣n chủng sản xuất vaccine phù hợp , do virus LMLM không có tính miễn dịc h chéo.
Hình 3.4. Kết quả chẩn đoán các mẫu thực đĩa bằng phản ứng RT -PCR. M: thang DNA; 1-10: mẫu bệnh phẩm từ số 1-10 (Bảng 2.1).
Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với 10 mẫu bê ̣nh phẩm thu thâ ̣p từ trâu, bò trong các vụ dịch ở miền Bắc Viê ̣t Nam năm 2010 (Bảng 2.1), kết quả (Hình 3.4) cho thấy cả 10 mẫu bê ̣nh phẩm đều dương tính với virus LMLM. Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật real -time PCR sử du ̣ng bô ̣ ki t PirBright của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
3.3 Tách dòng xác định trình tự gen VP1 3.3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen VP1 3.3.1 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen VP1
Để khẳng đi ̣nh mô ̣t cách chắc chắn sản phẩm phả n ứng RT -PCR chính là gen VP1 của virus LMLM , chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định trình tự DNA của
các sản phẩm này . Ngoài ra, sản phẩm RT -PCR là toàn bô ̣ gen VP1, do đó viê ̣c lưu giữ các gen này là rất cần thiết để làm nguyên liê ̣u cho viê ̣c sản xuất vaccine thế hê ̣ mới hoă ̣c các ứng dụng khác sau này . Sản phẩm RT -PCR từ mẫu bệnh phẩm trên đươ ̣c gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen). Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector mang sản phẩm RT -PCR gen mã hóa protein VP 1 của virus LMLM. Vector tái tổ hơ ̣p thu đươ ̣c từ phản ứng gắn trên đươ ̣c biến na ̣p vào tế bào E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiê ̣t . Cấy trải thể biến na ̣p trên môi trường LB đă ̣c có bổ sung Amp , X-gal và IPTG , sau đó nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Trên môi trường này , khuẩn la ̣c mang vector tái tổ hợp chứa gen VP1 sẽ có màu trắng, còn khuẩn lạc mang vector pCR 2.1 tự đóng vòng không mang gen ngoa ̣i lai sẽ có màu xanh ( Hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. colichủng DH5α
Những khuẩn la ̣c có màu xanh là do vector pCR 2.1 mang gen lac-Z hoạt đô ̣ng bình thường tạo ra enzyme β-galactosidse chuyển hóa X -gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc màu trắng là do nhận đượ c plasmid tái tổ hơ ̣p mang gen
lac-Z không hoạt đô ̣ng, do đoa ̣n DNA ngoa ̣i lai xen vào giữa lac promoter và gen cấu trúc lac-Z của operon Lac . Trong trường hợp này, lac promoter không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã nên không có sự dịch mã thành enzyme β-galactosidasa để phân hủy cơ chất X-gal do đó khuẩn la ̣c có màu trắng.
Để cho ̣n được các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen VP1, chúng tôi nhặ t mô ̣t số khuẩn la ̣c trắng và mô ̣t khuẩn la ̣c xanh (làm đối chứng) nuôi cấy trong môi trườ ng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp qua đêm, sau đó tách chiế t plasmid từ các tế bào đó và kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel agarose 1%. Trong quá trình điê ̣n di, phân tử DNA nào có kích thước càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh trong điê ̣n trường , ngược lại phân tử DNA có ích thước lớn thì di chuyển chậm hơn . Từ kết quả điê ̣n di kiểm tra ta thấy hầu hết các DNA plasmid tách từ khuẩn la ̣c trắng có kích thước lớn hơn DNA plasmid tá ch từ khuẩn la ̣c xanh . Điều này có khả năng do các plasmid tách từ
M 1 2 3 4 5
khuẩn lạc màu trắng có g ắn thêm sản phẩm RT-PCR nên kích thước lớn hơn DNA plasmid gốc. Tiếp theo chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra các DNA plasmid này bằng enzym giớ i ha ̣n.
Do vector tách dòng s ử dụng trong nghiên cứu có 2 vị trí cắt của enzyme
EcoRI ở 2 đầu của vùng cắt g ắn đa vi ̣, vị trí gắn của DNA ngoại lai , nên nếu các dòng DNA plasmid có gắn sản phẩm RT -PCR thì sau khi xử lý bằng enzym này sẽ văng ra 1 đoa ̣n DNA có chiều dài tương đương với chiều dài sản phẩm RT -PCR gắn vào . Bằng phương pháp này chúng tôi đã cho ̣n được cả 10 dòng plasmid tái tổ hơ ̣p mang sản phẩm RT -PCR gen VP1 khuếch đa ̣i từ 10 mẫu bê ̣nh phẩm trong nghiên cứu (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di các dòng DNA plasmid tái tổ hơ ̣p sau khi x ử lý bằng EcoRI. Đường chạy M: thang DNA chuẩn, Đường chạy 1-5: plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm RT-PCR từ các mẫu bê ̣nh phẩm từ số 1-5 cắt với E.coR I.
Tiếp theo chúng tôi tiến hành giải trình tự các dòng plasmid tái tổ hợp thu được
ở trên và so sánh với các trình tự gen VP1 đã được công bố trên Genbank.
3.3.2 Giải trình tự gen mã hóa protein VP1
Vì ch ất lượng của phản ứng xác định trình tự phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh sạch của mẫu DNA plasmid . Do đó trước khi tiến hành quá trình giải trình tự , chúng tôi tiến hành tinh sa ̣ch các dòng DNA plasmid đã phân tích bằng enzyme EcoRI trên bằng S.N.A.P miniprep Kit (Invitrogen). Kết quả tinh s ạch được kiểm tra bằng điê ̣n di trên gel agarose 1% và đo OD ở bước sóng 260 và 280 nm. Kết quả đo OD đều cho kết quả A260/A280 đều trên 1.8 (kết quả không trình bày ở đây ). Như vậy DNA plasmid có độ tinh sạch cao, đảm bảo cho việc xác định trình tự DNA.
Các plasmid này sau đó được xác định trình tự DNA trên máy xác định trình tự DNA tự đô ̣ng ABI prism 3100 Sequenser ( Applied Biosytems ) với bô ̣ kit xác đi ̣nh trình tự BigD ye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit củ a hãng Applied Biosytems. Quá trình giải trình tự được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu .
Sau khi giải trình tự, trình tự gen được phân tích bằng phần mềm Bioedit và BLAST. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen vừa tách dòng với các gen đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Kết quả so sánh trình tự cho thấy, gen VP1 được tách dòng từ 10 mẫu bệnh phẩm đều là gen mã hóa protein VP1 của virus LMLM type O , đồng thời khẳng đi ̣nh chúng tôi đã tách dòng thành công gen mã hóa protein VP 1 của các chủng virus LMLM lưu hành tại Việt Nam.
So sánh trình tự gen VP1vừa tách dòng từ 10 mẫu bê ̣nh phẩm virus LMLM phân lập ở các đ ịa phương khác nhau ở Việt Nam năm 2010 (Bảng 2.1) cho thấy chúng hoàn toàn giống nhau. Phân tích sâu hơn chúng tôi nhâ ̣n thấy, gen VP1 thuộc type O phân lập từ gia súc ở Việt Nam năm 2010 có độ tương đồng gần cao (99- 100%) so với gen VP1 của cùng type lưu hành trong nước năm 2009. Điều đó cho thấy virus type O lưu hành trong nước hiện chưa có biến đổi so với chủng gây bệnh năm 2009. So với các chủng virus cùng type lưu hành ở các nước trong khu vực cũng cho kết quả tương tự. Chủng virus LMLM type O lưu hành tại Việt Nam năm 2010 có độ tương đồng rất cao so với các chủng lưu hành ở Myanma, Đài Loàn, Lào từ năm 2009-2010. Tuy nhiên so với các chủng lưu hành trước năm 2009 thì đã có sự biến đổi khá lớn, mức độ tương đồng từ 91-96%.
Tuy nhiên khi so sánh với trình tự gen VP1 từ chủng virus LMLM type O g ây dịch bệnh trong nước vào năm 2006 (mã số GU582108.1), chúng tôi nhận thấy chúng có sự biến đổi rất lớn. Độ tương đồng trình chỉ đạt 90,4 % và 94,3% tương ứng ở mức độ gen và mức đô ̣ protein . Kết quả nghiên cứu này gợi ý rằng cần có những nghiên cứu sâu hơn về các chúng virus LMLM đang lưu hành trong nước để từ đó có chiến lược sản xuất và sử dụng vaccine trong nước phù hợp , vì nếu vaccine đang dùng được phát triển trên cơ sở các chủng virus LMLM gây đại dich từ nhiều năm trước có thể không có hoặc có công hiệu phòng vệ kém với các chủng virus hiện đang lưu hành.
3.4 Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loa ̣i
Phân tích tiếp dựa trên cây phát sinh chủng loa ̣i (Hình 3.7) cho thấy, các type virus LMLM nghiên cứu có đ ộ tương đồng di truyền gần với các chủng virus ở Lào, Hongkong, Myanma và Malaysia từ năm 2008 trở lại đây. Đối với các chủng virus từ năm 2008 trở về trước hoặc có khoảng cách xa v ề mặt địa lý như Ai Cập, Israel,…mức độ tương đồng có khoảng cách khá xa so với các ch ủng virus trong nghiên cứu này. Phân tích cây phả hê ̣ dựa trên trình tự gen VP 1 còn cho thấy, tất cả các virus LMLM type O trong nghiên cứu đều thuộc nhóm SEA (South East Asia).
Hình 3.7. Cây phát sinh dựa trên trình tự gen VP1 của virus LMLM so sánh mối quan hệ giữa type O phân lập ở Việt Nam và các type virus LMLM khác trên thế giới. Phân tích dựa trên phương pháp neighbor-joining với giá trị lấy mẫu bootstrap là 1000, chỉ có giá trị trên 60% được đưa ra. ● Các chủng thu nhận tại Việt Nam được phân tích trong bài báo.
Như chúng ta đã biết, sự biến đổi kháng nguyên trong một type huyết thanh là một cơ chế để virus thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ. Trong số 7 type huyết thanh virus LMLM, type A và type O có tính kháng nguyên và di truyền đa dạng nhất, khó kiểm soát bằng cách tiêm chủng vaccine [27, 30, 44]. Protein vỏ VP1 được nghiên cứu nhiều nhất bởi vai trò của chúng trong sự lây nhi ễm của virus và ch ống lại hệ miễn dịch củ a vâ ̣t chủ [11,26].
Nghiên cứu dịch tễ học và phân tử của các chủng virus LMLM là quan trọng và rất hữu ích trong việc theo dõi sự tiến hóa và nguồn gốc của virus và phát triển các kit chẩn đoán và vaccine phòng vệ [19]. Dựa vào những k ết quả thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi gơ ̣i ý c ần lựa chọn các loại vaccine có nguồn gốc gần với các chủng như O/MOG/7/2010; O/MYA/12/2009; O/MAY/21/2009; O/HONGKONG/P424/2011. Việc các virus thuộc type O có khoảng cách di truyền xa so với virus type A (Hình 3.7) cũng là minh chứng cho thấy các type virus LMLM không có tính miễn di ̣ch chéo.
KẾT LUẬN
1.Đã xây dựng thành công kỹ th uâ ̣t RT-PCR phát hiện nhanh virus LMLM và
