ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1.1 Phương pháp vật lý
• Phương pháp xác định khối lượng từng phần:
Cân khối lượng toàn phần M (g) của quả dứa, sau đó chia quả dứa thành các phần khác nhau theo sơ đồ hình 3.1, riêng phần chồi ngọn bỏ lá xanh (hình 3.3.). Cân lần lượt khối lượng của từng phần mi (g).
% Tỷ lệ khối lượng của từng phần (Gi) được xác định theo công thức sau: Gi (%) = (mi/M) * 100
Hình 3.3. Chồi ngọn dứa
Dịch của từng phần chồi ngọn, vỏ, thịt quả, lõi quả được thu hồi theo phương pháp vật lý theo sơ đồ hình 3.4.3 như sau:
Nguyên liệu là các phần của quả dứa (chồi ngọn, vỏ, thịt quả, lõi quả ) được cân xác định khối lượng ban đầu sau đó được đem đi xé, nghiền nhằm mục đích phá vỡ cấu trúc tế bào tạo điều kiện cho việc giải phóng enzyme. Hỗn hợp sau đó được lọc thô để loại bỏ các mảnh vụn nguyên liệu, dịch sau lọc thô được ly tâm tách bỏ các vụn tế bào nhỏ. Dịch trong thu được sau khi ly tâm chính là dịch enzyme thô sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt lực và tách thu hồi enzyme.
Hình 3.3. Chồi ngọn dứa
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình thu dịch enzyme từ các phần quả dứa 3.3.2. Phương pháp hóa sinh
3.3.2.1. Xác định chất khô tổng số bằng sấy đến khối lượng không đổi
• Nguyên lý: sử dụng nhiệt độ làm bay hơi toàn bộ lượng nước có trong mẫu, lượng còn lại là chất khô tổng số.
• Cách tiến hành: lấy 1 – 2g mẫu cho vào máy xác định hàm ẩm, bật máy. Máy có chế độ chạy tự động, khi mẫu được sấy đến khối lượng không đổi, máy tự động dừng lại và báo kết quả trên màn hình hiển thị. Số liệu hiển thị chính là phần chất khô tổng số. Từ đó ta có phần trăm chất khô tổng số.
3.3.2.2. Xác định hoạt lực protease theo phương pháp Anson cải tiến
• Nguyên tắc
Cân
Nghiền, xé (nếu cần)Nước cất
Ép lấy dịch
Lọc thô
Ly tâm
Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân protein casein bằng chế phẩm enzyme có trong dung dịch nghiên cứu rồi tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng acid trichloacetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thuỷ phân bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrosine để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzyme xúc tác tạo nên.
Định nghĩa đơn vị họat độ protease:
Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme trong thời gian 1 phút ở 30oC 30o C chuyển hoá được một lượng casein tương đương một micromol tyrosine thành dạng không bị kết tủa bởi acid trichloacetic. Một mol tyrozsine bằng 0.181mg.
• Hoá chất
- Đệm vạn năng 0.1M
+ Pha dung dịch (A) acid acetic 0.1M, lên 1lít. + Pha dung dịch (B) acid phosphoric 0.1M, lên 1lít. + Pha dung dịch (C) acid octo-boric 0.1M, lên 1 lít. + Pha dung dịch (D) natri hydroxit 1N.
Trộn lẫn các dung dịch A, B, C với thể tích bằng nhau ta được hỗn hợp đệm có pH = 1.8. Thêm vào hỗn hợp này các lượng NaOH 1N khác nhau và sử dụng máy đo pH, ta được các dung dịch đệm có mức pH cần dùng.
- Dung dịch acid trichloacetic 0.3M. - Dung dịch natricacbonat 0.5M. - Dung dịch HCl 0.2N.
- Dung dịch thuốc thử folin 0.5N.
- Dung dịch cơ chất: pha dung dịch cơ chất (casein, peptone hoặc cao nấm men) 2% bằng đệm vạn năng có pH tuỳ thuộc vào pH thí nghiệm.
• Cách tiến hành
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống có 2ml cơ chất, rồi đặt vào máy điều nhiệt ở 30oC. Sau 10 phút, cho vào mỗi ống 2ml dung dịch enzyme, lắc trộn đều và để cho thuỷ phân đúng 10 phút ở 30oC. Đình chỉ phản ứng enzyme bằng cách thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 4ml acid trichloacetic 0.3M, khi đó protein dư cũng như sản phẩm thuỷ phân cao phân tử sẽ bị kết tủa. Khuấy trộn nhanh hỗn hợp để kết tủa hoàn toàn protein rồi giữ các ống nghiệm ở 30oC thêm 20 phút nữa. Sau đấy lọc hỗn hợp qua giấy lọc khô trên phễu nhỏ vào các ống nghiệm khô khác, dịch lọc phải thật trong. Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm và thêm vào đó 5ml dung dịch Na2CO3, khuấy đều liên tục và thêm 1ml thuốc thử folin phân tích. Để yên hỗn hợp phản ứng 20 phút. Sau phản ứng dung dịch có màu xanh da trời. Đo cường độ màu của dung dịch trên máy so màu quang điện đối ngược với mẫu kiểm chứng tại bước sóng λ = 670 nm.
Tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng bằng cách thêm vào các hoá chất khác theo thứ tự ngược lại: thêm vào 2ml dung dịch enzyme (có độ pha loãng như ở mẫu thí nghiệm), 4ml acid trichloacetic 0.3M, giữ hỗn hợp trong máy điều nhiệt 10 phút ở 30oC, sau đó mới thêm vào 2ml dung dịch cơ chất và giữ 20 phút ở nhiệt độ này. Qua 20 phút, đem lọc dung dịch. Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm khô, thêm 5ml Na2CO3 0.5M, khuấy đều liên tục và cho thêm 1ml thuốc thử folin phân tích.
Đo cường độ màu của các dung dịch thí nghiệm bằng máy so màu với cu - vet có chiều dày lớp hấp thụ ánh sáng là 1cm và ở bước sóng λ = 670 nm.
Hoạt độ protease (HdP) tính bằng U/ml được xác định theo công thức: HdP = TED..410.f.v
Trong đó:
D: mật độ quang đo được của mẫu.
4: tỷ lệ giữa thể tích của hỗn hợp phản ứng và thể tích của dung dịch enzyme sau khi bổ sung acid trichloacetic (2ml(S)+2ml2ml(E(E)+) 4ml(TCA)= 4).
TE: Đương lượng tyrosine xác định theo đường chuẩn (đương lượng tyrosine là mật độ quang mà 1µmol tyrosine có trong 1ml dung dịch chuẩn khi phản ứng với thuốc thử folin có thể có được), TE = 1.8652 (phụ lục 1).
10: thời gian thuỷ phân cơ chất, phút. v: thể tích enzyme đã pha loãng, ml. f: hệ số pha loãng enzyme.
3.3.2.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry
• Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử folin. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa theo đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này, có thể dễ dàng tính được hàm lượng protein của mẫu vật nghiên cứu.
• Hoá chất
- Thuốc thử folin 0.5N.
- Dung dịch Na2CO3 2% pha trong NaOH 0.1N (dung dịch A). - Dung dịch CuSO4.5H2O 0.5N (dung dịch B).
- Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỷ lệ 50 : 1 trước khi dùng (dung dịch C).
• Cách tiến hành
Lấy 2 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm khô rồi thêm vào đó 1 ml dung dịch C, lắc đều và để yên 10 phút ở nhiệt độ thường. Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0.1ml thuốc thử folin, trộn đều. Qua 30 phút màu vàng của hỗn hợp phản ứng chưyển sang màu xanh thẫm. Đo cường độ màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750 nm. (Ống kiểm chứng thay dung dịch protein bằng nước cất). Nồng độ protein có trong dung dịch nghiên cứu tính theo đường chuẩn của protein tinh khiết albumin trứng (phụ lục 2).