Nguyên lý: Hàm lượng axít béo tự do được xác định theo phương pháp của Lowry và Tinsley (1976) với một vài hiệu chỉnh nhỏ.
Tiến hành: Khoảng 0,3 – 0,5 g dầu được chiết theo phương pháp của Bligh and Dyer (1959) trộn với 5 ml benzene, sau đó thêm 1 ml dung dịch phản ứng Cu- acetate-pyridine, hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút trước khi được ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 5 phút (Centrifuge, Labentech, Mega 17R, Germany). Phần dịch trong ở lớp trên được đem đi xác định độ hấp thụ quang học ở bước sóng 715 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Hàm lượng FFA được tính toán từ đường chuẩn axít Oleic. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả phân tích được tiến hành lặp lại để đảm bảo thực hiện phân tích ANOVA. Hàm lượng polyphenol, giá trị IC50 của khả năng khử gốc tự do DPPH, năng lực khử, FFA, HPO và TBARS được thực hiện ít nhất hai lần lặp lại. Số liệu được phân tích trên phần mềm SPSS 16.0. Kiểm định Tukey được thực hiện sau phân tích sâu ANOVA để đánh giá sự khác nhau của các giá trị với mức ý nghĩa p < 0,05. Vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng polyphenol tổng của lá Trầu không
Hàm lượng ẩm và polyphenol tổng của lá Trầu không được trình bày trong Bảng 3.1. Kết quả cho thấy Lá trầu không có hàm lượng nước khá cao, chiếm 84,72% khối lượng ướt. Với đặc điểm hàm lượng nước cao nên lá Trầu không có cấu trúc mềm mại, lỏng lẻo, dễ bị tổn hại cơ học, dập nát làm ảnh hưởng đến hoạt tính của chất chống oxi hóa có trong lá Trầu không. Vì vậy, để thuận tiện trong quá trình bảo quản và nấu chiết thì ta phải làm khô sao cho hàm lượng nước trong lá Trầu không xuống đến độ ẩm khoảng 10%. Làm khô giúp thuận tiện cho quá trình xay nhỏ, giảm kích thước, tạo độ đồng đều cho mẫu giúp quá trình nấu chiết đem lại hiệu quả cao hơn.
Bảng 3.1 cũng chỉ ra hàm lượng polyphenol tổng của lá Trầu không. Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng của lá Trầu không là 188,20 ± 0,36 mg GAE/g chất khô. Polyphenol là những hợp chất thường có được tìm thấy nhiều trong thực vật. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol trong lá Trầu không là khá cao so với một số loại thực vật khác. Một số tác giả đã công bố hàm lượng polyphenol trong một số loại thực vật. Kết quả nghiên cứu của Marja và cộng sự (1999) khi nghiên cứu hàm lượng polyphenol của 92 loại thực vật ăn được và không ăn được đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của chúng dao động khá rộng trong khoảng từ 0,2 đến 155,3 mg GAE/g chất khô. Theo nhóm tác giả này những loại thực vật có hàm lượng polyphenol lớn hơn 20 mg GAE/g chất khô thì có hoạt tính chống oxi hóa mạnh. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hàm lượng polyphenol của lá Trầu không cao hơn mức khuyến cáo của Marja và cộng sự (1999) là 9,41 lần.
Polyphenol là những hợp chất hữu cơ thể hiện khả năng chống oxi hóa. Kết quả nghiên cứu này cho thấy lá Trầu không có hàm lượng polyphenol cao có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để thu nhận các chất có hoạt tính chống oxi hóa nguồn gốc tự nhiên có thể ứng dụng trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm. Tuy nhiên, để
khẳng định khả năng chống oxi hóa cần tiến hành các phân tích trên in vitro để khẳng định khả năng chống oxi hóa của lá Trầu không.
Bảng 3.1. Hàm lượng ẩm và hàm lượng polyphenol tổng của lá Trầu không
Thành phần Hàm lượng Đơn vị
Hàm lượng ẩm 84,72 ± 0,36 %
Polyphenol tổng 188,20 ± 1,77 mg acid Gallic/g chất khô
3.2. Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch chiết lá Trầu không thông qua
khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
Khả năng thu gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong in vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxi hóa sử dụng phép phân tích này (Joon-Kwan và Takayuki, 2009). Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ lá Trầu không được thể hiện trong Hình 3.1. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá Trầu không thể hiện khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH. Khi tăng thể tích dịch chiết từ 30 µl lên 120 µl dịch chiết thì khả năng khử gốc tự DPPH cũng tăng theo. Trong phạm vi nghiên cứu này, sự tăng khả năng khử gốc tự do DPPH có mối tương quan tuyến tính khá chặt với thể tích dịch chiết sử dụng (R2 = 0,9991). Mối tương quan giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do có dạng: y = 0,4434x + 2,4422, trong đó y là khả năng khử gốc tự do DPPH, x là thể tích dịch chiết. Giá trị IC50 của dịch chiết có khả năng khử được 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện thí nghiệm được xác định từ mối quan hệ tuyến tính giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do DPPH (Hình 3.1). Kết quả cho thấy giá trị IC50 của dịch chiết là 107,26 µl. Điều này tương đương với 0,18 mg nguyên liệu khô.
Dịch chiết của lá Trầu không có khả năng kháng oxi hoá mạnh, thể hiện thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH có thể được lý giải là do trong dịch chiết lá Trầu không có chứa các chất chống oxi hóa, mà điển hình là các hợp chất polyphenol như đã được trình bày ở phần trên. Một số tác giả khác cũng đã báo cáo khả năng chống oxi hóa của dịch chiết là Trầu không (Lakshmi và cộng sự (2006); Nabasree và
Bratati (2004). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tiềm năng có thể sử dụng lá Trầu không làm nguồn chiết suất các chất chống oxi hóa và khả năng áp dụng dịch chiết này trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm.
Hình 3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá Trầu không 3.3. Xác định tổng năng lực khử của dịch chiết lá Trầu không
Tổng năng lực khử cũng là một phép thử trên in vitro nhằm đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch chiết. Kết quả xác định tổng năng lực khử của dịch chiết lá Trầu không được trình bày trong Hình 3.2. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng khử của dịch chiết lá Trầu không phụ thuộc vào thể tích dịch chiết. Nói cách khác, khả năng khử phụ thuộc vào hàm lượng chất chống oxi hóa trong dịch chiết. Khi tăng thể tích dịch chiết điều đó cũng cõ nghĩa tăng hàm lượng chất chống oxi hóa, nên khả năng chống oxi hóa tăng lên. Trong phạm thể tích dịch chiết từ 0,1 ml đến 0,75 ml, độ hấp thu quang học ở bước sóng 700 nm (Abs 700) có mối tương quan khá chặt với thể tích dịch chiết sử dụng. Mối tương quan này thể hiện theo phương trình: y = 2,7923x + 0,3251 (R2 = 0,9963), trong đó: y là độ hấp thu quang học ở bước sóng 700 nm, x là thể tích dịch chiết sử dụng (ml).
Giá trị IC50 là thể tích dịch chiết sử dụng làm tăng độ hấp thu quang học ở bước sóng 700 nm lên 0,50 (trích dẫn tác giả). Từ kết quả Hình 3.2 cho thấy giá trị IC50 là 62,22 µl. Điều này tương đương với 0,10 mg nguyên liệu khô.
Dịch chiết của lá Trầu không có khả năng chống oxi hóa thể hiện thông qua tổng năng lực khử có thể được lý giải là do trong dịch chiết lá Trầu không có chứa các chất chống oxi hóa, mà điển hình là các hợp chất polyphenol như đã được trình bày ở phần trên. Một số tác giả khác cũng đã báo cáo khả năng chống oxi hóa của dịch chiết là Trầu không (Lakshmi và cộng sự (2006); Nabasree và Bratati (2004)). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tiềm năng có thể sử dụng lá Trầu không làm nguồn chiết suất các chất chống oxi hóa và khả năng áp dụng dịch chiết này trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm.
Hình 3.2 . Tổng năng lực khử của dịch chiết lá Trầu không
3.4. Khả năng chống oxi hóa của dịch chiết lá Trầu không trên mô hình dầu – nước
Khả năng kháng lại sự hình thành Hydroperoxide (HPO) trên môn hình dầu nước sử dụng dầu olive 10% của dịch chiết lá Trầu không được thể hiện trên Hình 3.3. Kết quả cho thấy dịch chiết lá Trầu không (TK) có khả năng hạn chế đáng kể sự hình thành HPO so với mẫu đối chứng (ĐC) và mẫu có sử dụng BHA 100 µg/ml
(BHA). Hàm lượng HPO của mẫu TK sau 7 ngày bảo quản là 13,85 nmol/ml, trong khi đó của mẫu ĐC và BHA lần lượt là 22,25 nmol/ml và 19,25 nmol/ml. Kết quả nghiên cứu này cho thấy dịch chiết lá Trầu không ức chế hiệu quả sự hình thành Hydroperoxide trên mô hình dầu-nước. Đây là cơ sở để tiến tới áp dụng dịch chiết lá Trầu không trong mô hình thực phẩm thực.
Hình 3.3. Khả năng chống oxi hóa của dịch chiết lá Trầu không trên mô hình dầu – nước
3.5. Khả năng hạn chế sự oxi hóa chất béo thịt cá Dầu bảo quản lạnh bằng dịch chiết lá Trầu không
3.5.1. Sự thay đổi a xít béo tự do (FFA) trong quá trình bảo quản lạnh thịt cá Dầu
Sự thay đổi hàm lượng a xít béo tự do (FFA) của thịt cá Dầu trong quá trình bảo quản lạnh ở 5oC được trình bày trong Hình 3.4. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng FFA tăng theo thời gian bảo quản lạnh. Thịt cá Dầu xử lý ngâm trong dịch chiết lá Trầu không trong 10 và 20 phút hạn chế đáng kể (p < 0,05) sự hình thành a xít béo tự do so với mẫu đối chứng (ĐC) sau 9 ngày bảo quản lạnh. Hàm lượng FFA của mẫu ĐC sau 9 ngày bảo quản lạnh là 1,116 g/100 g chất béo, trong khi đó mẫu xử lý ngâm dịch chiết lá Trầu không trong 10 phút (XL 10) và 20 phút (XL 20) lần lượt là 0,791 và 0,721 g/100 g chất béo. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc xử
lý ngâm thịt cá Dầu trong dịch chiết lá Trầu không trong 10 và 20 phút không có sự khác nhau đáng kể về sự hình thành FFA. Điều này có thể được lý giải là do khả năng khuyếch tán chậm của dịch chiết vào tổ chức cơ thịt của thịt cá, sự khác biệt 10 phút có lẽ không đủ để dịch chiết ngấm sâu vào bên trogn tổ chức cơ thịt. Theo kết quả nghiên cứu thì có thể chỉ cần ngâm thịt cá trong 10 phút là thời gian xử lý phù hợp.
Sự tăng hàm lượng FFA do phản ứng thủy phân chất béo (lipid) theo 2 con đường sinh học (enzyme lipaza) và hóa học (nước), sản phẩm cuối cùng của phản ứng thủy phân sinh ra glycerin và acid béo tự do:
Triglyceride → Diglyceride + a xít béo tự do → Monoglyceride + a xít béo tự do → Glyceride + a xít béo tự do.
Nhìn chung, các nhà khoa học cho rằng các a xít béo ở dạng tự do dễ bị oxi hóa hơn acid béo ở dạng liên kết este (Labuza, 1971); Ashton và cộng sự (2002). Sự hình thành FFA là giai đoạn đầu khởi mào cho các phản ứng oxi hóa chất béo xảy ra trong cơ thịt cá. Vì vậy, nếu hàm lượng FFA tăng lên trong quá trình bảo quản lạnh thịt cá Dầu điều đó cũng có nghĩa là khả năng chất béo bị trong thịt cá bị oxi hóa trong quá trình bảo quản là có thể xảy ra. Tuy nhiên để đánh giá điều này cần tiến hành phân tích các chỉ tiêu đánh giá mức độ oxi hóa chất béo khác.
Khả năng hạn chế sự hình thành FFA của các mẫu ngâm dịch chiết có thể được lý giải là do khả năng hạn chế sự oxi hóa chất béo của dịch chiết lá Trầu không như đã được thảo luận ở phần trên.
Hình 3.4. Sự thay đổi a xít béo tự do (FFA) của thịt cá Dầu trong quá trình bảo quản lạnh
3.5.2. Sự thay đổi hàm lượng Hydroperoxide (HPO) trong quá trình bảo quản lạnh thịt cá Dầu
Như đã được thảo luận ở phần trên hàm lượng FFA tăng trong quá trình bảo quản lạnh. Điều đó sẽ xúc tiến cho các quá trình oxi hóa chất béo sâu sắc hơn ở những giai đoạn sau. Thật vật, kết quả nghiên cứu được trình bày trong Hình 3.5 về sự thay đổi hàm lượng Hydroperoxide (HPO) của thịt cá Dầu trong quá trình bảo quản lạnh đã minh chứng cho nhận định trên. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng HPO có xu hướng tăng theo thời gian bảo quản. Tuy nhiên, vì HPO là một sản phẩm trung gian của quá trình oxi hóa chất béo, không bền nên dễ bị oxi hóa để tạo thành các sản phẩm bậc hai. Sau 5 ngày bảo quản hàm lượng HPO tăng đều ở cả ba mẫu nghiên cứu sau đó có một sự suy giảm đáng kể ở mẫu đối chứng (ĐC) và sự giảm nhẹ ở các mẫu xử lý ngâm dịch chiết lá Trầu không trong 10 phút (XL 10) và 20 phút (XL 20) trước khi có sự tăng nhẹ trở lại ở thời điểm 9 ngày bảo quản của hai mẫu này.
Hàm lượng HPO của mẫu ĐC tằng đáng kể từ giá trị ban đầu 1813 nmol/g chất béo lên 3995 nmol/g chất sau 5 ngày bảo quản trước khi giảm xuống còn 2839 nmol/g chất béo ở ngày bảo quản thứ 9. Đối với mẫu XL 10, sau khi tăng từ 1525
nmol/g chất béo (0 ngày bảo quản) lên 2393 nmol/g chất béo (5 ngày bảo quản) trước khi giảm nhẹ ở cuối gian đoạn bảo quản 9 ngày với giá trị là 2308 nmol/g chất béo. Một xu hướng tương tự cũng được ghi nhận đối với mẫu XL 20. Hàm lượng HPO ở thời điểm 0 ngày, 5 ngày và 9 ngày bảo quản lần lượt là 1705, 2111 và 2063 nmol/g chất béo.
Kết quả phân tích thống kê cho thấy hàm lượng HPO giữa hai mẫu XL 10 và XL 20 không có sự khác biệt đáng kể (p > 0,05) mặc dù chúng có sự khác biệt đáng kể so với mẫu ĐC (p < 0,05). Khả năng hạn chế sự hình thành HPO ở hai mẫu XL so với mẫu ĐC có thể được lý giải là do khả năng chống oxi hóa của dịch chiết lá Trầu không khi xử lý thịt cá đã ngấm vào tổ chức cơ thịt và ngăn chặn hiệu quả sự hình thành HPO trong quá trình bảo quản lanh thịt cá. Kết quả nghiên cứu này mở ra tiềm năng có thể sử dụng các chất chống oxi hóa nguồn gốc tự nhiên để hạn chế quá trình oxi hóa chất béo nhằm cải thiện chất lượng thủy sản sau thu hoạch cũng như trong quá trình chế biến.
Hình 3.5. Sự thay đổi hàm lượng Hydroperoxide (HPO) trong quá trình bảo quản lạnh thịt cá Dầu
Để đánh giá mức độ oxi hóa chất béo ở mức độ sâu sắc hơn, người ta thường sử dụng chỉ số TBARS. Kết quả nghiên cứu được chỉ ra trong Hình 3.6 cho thấy chỉ số TBARS của thị cá Dầu tăng đáng kể theo thời gian bảo (p < 0,05). Theo đó, mẫu đối chứng (ĐC) có chỉ số TBARS tăng mạnh nhất từ 0,530 mg MAD/kg thịt cá (0 ngày bảo quản) lên 1,350 mg MAD/kg thịt cá (9 ngày bảo quản), mức độ tăng khoảng 2,55 lần. Trong khi đó, đối với mẫu thịt cá xử lý ngâm dịch chiết lá Trầu không 10 phút (XL 10) thì chỉ số TBARS ở thời điểm 0 ngày và 9 ngày bảo quản lần lượt là 0,580 và 1,175 mg MAD/kg thịt cá. Tương tự như vậy, đối với mẫu thịt cá xử lý ngâm trong 20 phút dịch chiết (XL 20) là 0,540 và 1,135 mg MAD/kg thịt cá.
Phân tích thống kê cho thấy chỉ số TBARS của các mẫu ở thời điểm 9 ngày bảo quản có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu đối chứng và các mẫu xử lý (p < 0,05). Điều đó cho thấy khả năng hạn chế sự oxi hóa chất béo hiệu quả của dịch chiết lá Trầu không. Khả năng hạn chế sự hình thành các sản phẩm của quá trình oxi hóa chất béo trong thịt cá thể hiện qua chỉ số TBARS ở hai mẫu XL so với mẫu ĐC có thể được lý