- Qua tất cả các công trình nghiên cứu về chitin – chitosan, dễ thấy rõ ràng nguyên tắc chung của sản xuất chitin – chitosan khử khoáng bằng acid vô cơ, khử protein bằng kiềm. Trong phương pháp sinh học này sẽ tiến hành thay tác nhân khử khoáng bằng acid hữu cơ sinh ra qua quá trình sống của vi khuẩn lactic, và chính quá trình sống đó sẽ là tác nhân thủy phân protein trong nguyên liệu vỏ tôm.
- Chủng vi khuẩn được sử dụng trong phương pháp này là Lactobacillus
acidophilus lấy từ nguồn dược phẩm. ANTIBIO của Hanwha Pharm Co-
KOREA, mang chủng vi sinh L. acidophillus, mật độ 109 cfu/g.
Sơ lược về Lactobacillus acidophillus
- Phân loại: Giới: Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp: Bacilli Họ: Lactobacillaceae Chi: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus acidophillus
- Điểm đặc trưng phổ biến phân biệt chúng so với phần lớn các chi khác là dạng hình que và khả năng sinh acid lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu. Ngoài ra, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thanh bào tử và hiếm khi di động. Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5 – 1)×(1 – 10)µm, đôi khi
29
gần giống dạng hình cầu trong điều kiện nào đó và thường hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại độc lập.
- Nhiệt độ phát triển tối ưu khoảng 30 – 40oC nhưng chúng có thể sinh trưởng trong phạm vi 5 – 53oC.
- Đặc tính quan trọng nhất của chủng vi sinh này là khả năng sinh acid lactic mạnh, và chịu được môi trường có pH thấp. Khoảng pH tối ưu cho chúng phát triển là 5,5 – 5,8, nhưng nhìn chung chúng có thể sinh trưởng ở pH < 5.
- Ngoài ra người ta có thể dựa trên các sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng để phân loại các loài Lactobacillus thành 2 loại. Các loài lên men đồng hình và các loài lên men dị hình. Các loại thuộc nhóm lên men đồng hình tạo ra 85% acid lactic từ glucose, trong khi loài lên men dị hình chỉ tạo ra 50% acid lactic và một lượng đáng kể carbon dioxide, acetate và ethanol. L. acidophilus là một chủng lên men đồng hình đặc trưng nhất.
- Lactobacillus acidophilus: L. acidophilus là thành viên của một trong tám chi chính của vi khuẩn axit lactic. Mỗi chi và các loài có đặc điểm khác nhau nhưng nói chung chúng là những cầu khuẩn dạng que, Gram (+) , không di động , sử dụng đường glucose, aesculin, cellobiose, galactose, lactoza, mantoza, salicin và sucrose, vi khuẩn không hình thành bào tử, yếm khí, sản xuất axit lactic là một sản phẩm chủ yếu hoặc duy nhất của sự trao đổi chất lên men lactose và sử dụng làm nguồn carbon để sản xuất năng lượng . Ngoài ra quá trình đồng hóa còn tạo ra lipase, amylase, protese và đặc biệt là acidophilin. L. acidophilus có thể sống trong môi trường có tính axit cao pH 4 – 5 hoặc thấp hơn và được mô tả như là một ví dụ loại lên men đồng hình sản xuất axit lactic là sản phẩm duy nhất (Vijayakumar et al., 2008).
30
- Quy trình khử khoáng và khử protein trên vỏ tôm sú để sản xuất chitin nguồn nguyên liệu sản xuất ra chitosan.
2.3.3. Thuyết minh quy trình
Bước 1: Rửa sơ bộ vỏ tôm
Vỏ tôm sú
Rửa sơ bộ Phối trộn nguyên liệu Tỉ lệ nước : vỏ tôm 2,5:1 10,5% Đường. 0,875% CH3COONa 0.35% KH2PO4 Chitin Giống Lactobacillus acidophilus. Chỉnh pH 6.5 Gia nhiệt 80oC, 15p
Cấy giống trên 15%
Lên men 72h – 96h, 37oC. yếm khí, khuấy
Tẩy màu bằng H2O2 Rửa
31
Mục đích
- Loại bỏ bớt một phần vi sinh gây thối có sẵn trong vỏ tôm, loại bỏ tạp chất như rác, đất, cát…và một số thịt tôm bị thối rửa (giảm bớt mùi).
Tiến hành
- Cân một lượng xác định vỏ tôm, mang đi rửa trực tiếp bằng nước sinh hoạt bình thường, rủa qua một lần là đủ.
- Rạng vớt vỏ tôm lên để ráo nước.
Chú ý
- Không ngâm vỏ tôm quá lâu trong nước.
- Không rửa nhiều lần gây hao tốn nước mà còn rửa trôi hết phần thịt xót lại trên vỏ tôm, phần thịt này là nguồn cung cấp nitơ cho vi khuẩn duy nhất trong quá trình. Nếu thiếu thì quá trình khó thành công.
- Nên dùng thao chậu sạch để rửa, sẽ giảm thiểu tối đa nguồn nhiểm vi sinh vật gây thối.
- Vỏ tôm rửa xong cần để nơi khô ráo hoặc cho trực tiếp vào nồi lên men, xa nguồn nhiểm bẩn.
Bước 2: Phối trộn nguyên liệu
- Qua tìm hiểu các bài báo khoa học, và các đề tài nghiên cứu của khóa trước. Tuy nhiên hầu như còn một số vấn đề chưa giải quyết tốt nên hiệu suất quá trình chưa cao. Dựa trên nền tảng đó tôi tiến hành thực nghiệm sản xuất với một số cải biến từ công thức gốc như sau.
Mục đích
- Đây là một bước khá quan trọng, có thể nói nó quyết định quá trình xử lý có tốt hay không, lượng acid sinh ra càng nhiều thì hiệu quả xử lý càng cao.
- Mục đính của bước này là nhầm tạo một môi trường tối ưu nhất cho vi khuẩn phát triển, sinh ra lượng acid lớn nhất, pH giảm thấp nhất có thể.
- Bổ sung các thành phần khác mà có thể ức chế các vi sinh vật khác phát triển, giảm thiểu cạnh tranh môi trường sống cho chủng vi khuẩn ta cấy giống.
32
- Cân một lượng nguyên liệu và các chất theo bảng sau:
Bảng 2. 1 Công thức phối trộn nguyên liệu lên men
Quy về % so với vỏ tôm
Nước 250%
Sucrose 10,5%
CH3COONa 0,875% KH2PO4 0,35%
Chú ý
- Nguồn nước sử dụng trong quy trình phải là nguồn nước sinh hoạt hoặc tốt hơn. Dùng các nguồn nước khác sẽ không kiểm soát được chất lượng nước, nếu nước bị ô nhiễm gây ảnh hưởng quá trình.
- Cẩn thận là điều cần thiết, nên cẩn thận lấy và cân đúng hóa chất.
Bước 3: Xay vỏ tôm
Mục đích
- Nhầm đồng hóa các chất trong nguyên liệu.
- Vỏ tôm được xay nhỏ sẽ tăng bề mặt tiếp súc, phân bố đều trong môi trường.
Tiến hành
- Dùng máy xay bình thường hoặc có thể bâm bằng tay, tuy nhiên cần đạt yêu cầu là vỏ tôm càng nhuyển càng tốt, tối thiểu 2cm.
Bước 4: Gia nhiệt
Mục đích
- Giảm tối thiểu lượng vi sinh vật tạp nhiểm có trong môi trường lên men. - Đối với vi sinh vật sinh bào tử thì làm cho chúng chậm phát triển lại. - Tạo môi trường tương đối sạch, ưu thế cho L.acidophilus.
Tiến hành
- Cài đặt thiết bị hoạt động gia nhiệt 80oC trong 15 phút.
Chú ý
33
- Cần kiểm tra bảo trì thiết bị trước khi vận hành để đảm bào an toàn và hiệu quả.
Bước 4: Cấy giống
Mục đích
- Cung cấp sinh khối giống khởi động cho quá trình tăng trưởng vi khuẩn. - Tạo quần thể vi sinh vật phát triển cạnh tranh và ức chê vi sinh tạp khác. - Là tác nhân sinh acid và thủy phân protein trong quá trình sống.
Tiến hành
- Giống được tăng sinh 24h 37oC trên môi trường MRS. Có mật độ trên 3,5×105 cfu/ml.
- Cấy giống trực tiếp vào môi trường lên men. 15% thể tích giống (so với khối lượng vỏ tôm).
Chú ý
- Phải đảm bảo đủ mật độ và thể tích cần cấy. - Thao tác cấy giống vô trùng.
Bước 5: Lên men
Mục đích
- Duy trì các điều kiện như nhiệt độ, điều kiện yếm khí…tạo điều kiện cho vi sinh phát triển trong suốt thời gian cho tới khi kết thúc.
Tiến hành
- Sau khi cấy giống tạo điều kiện yếm khí, nhiệt độ 37oC duy trì 72 – 96h, có khuấy đảo theo chu kỳ 5phút khuấy 10 phút nghỉ.
Chú ý
- Kiểm tra thiết bị trước khi lên men.
- Kiểm tra hệ thống có hoạt động đều trong suốt thời gian lên men. Và quan sát 24h đầu có sinh khí (khí này có thể do vi sinh gây thối sinh ra, vì sau khi xả bỏ khí này đi thì cho tới lúc kết thúc lên men không thấy sinh khí nữa). Nếu 24h đầu sinh khí nhanh, xả khí đốt thử.
- Nếu cháy thì chắc chắn đã bị nhiểm vi sinh gây thối sinh khí CH4 chờ thêm vài giờ nữa xem chủng vi sinh ta cấy vào có ức chế được không ( thường là không
34
chủng sinh CH4 này khá mạnh) và nếu còn sinh khí và đốt cháy nữa thì nên bỏ ngay mẻ lên men, tiếp tục để sẽ rất thối. Nếu không còn khí sinh ra thì chứng tỏ chủng vi khuẩn ta cấy vào đã ức chế được, cho lên men tiếp.
- Nếu không cháy, thì chờ thêm vài giờ xem còn sinh khí không, nếu còn cũng tiến hành loại bỏ mẻ lên men, nếu không thì chứng tỏ chủng vi khuẩn ta cấy vào đã ức chế được và tiếp tục lên men.
- Quyết định cho lên men tiếp thì canh thời điểm 40 – 48h sau lên men tiến hành đo pH thấy có giảm thì cho lên men tiếp, nếu tăng thì tiến hành loại bỏ mẻ lên men.
Bước 6: Tẩy màu
- Sau lên men tiến hành vớt phần vỏ tôm ra khỏi dịch lên men, tốt hơn nên rửa nước ở công đoạn này rồi mới tẩy màu, tẩy màu xong sẽ rửa sạch, tuy nhiên cần tiết kiệm tối đa chi phí, vậy nên không rửa mà đi tiến hành tẩy màu trực tiếp. Có hai nguyên nhân thứ nhất là tiết kiệm chi phí sử dụng nước, thứ hai trên vỏ tôm còn nhiều sinh khối vi sinh vật, mặc dù đây là vi sinh vật đường ruột an toàn với người và vật nuôi, tuy nhiên nên có biện pháp loại trừ vẫn an toàn hơn. Vì vậy khi cho vào tẩy màu với H2O2 là một chât oxy hóa mạnh, khả năng diệt khuẩn rất cao.
Mục đích
- Vỏ tôm sau lên men sẽ có màu sắc vàng nhạt, đỏ nhẹ làm giảm giá trị cảm quan, giảm chất lượng chitosan khi dùng lượng chitin này làm nguyên liệu sản xuất. Do đó cần tẩy màu cho ra chitin trắng hơn, tạo giá trị cảm quan tốt hơn.
Tiến hành
- Dùng H2O2 ở nồng độ cao, cho vỏ tôm vào ngâm trực tiếp 2 – 3h, lượng sử dụng sao cho ngập đều vỏ tôm.
- Tiến hành khuấy đảo sau mỗi 15 phút ngâm. - Thu hồi lượng H2O2 có thể tái sử dụng lại.
35
- H2O2 là chất oxy hóa mạnh, nguy hiểm đối với người sữ dụng, không tiếp xúc da tay trực tiếp.
- Trang bị cẩn thận đồ bảo hộ lao động khi làm việc.
Bước 7: Rửa
Mục đích
- Sau lên men các thành phần khoáng liên kết trên vỏ tôm được tách ra, các ion khoáng này chủ yếu là canxi kết hợp với acid lactic tạo thành canxiumlactate, thành phần nữa là protein bị thủy phân sẽ nằm trong phần canh trường lên men và lớn nhất là sinh khối vi khuẩn sau lên men. Do đó để chitin được tinh sạch ta cần tiến hành rửa sạch bằng nước.
Tiến hành
- Dùng nước sinh hoạt bình thường rửa trôi hết dịch bả bám lại trên vỏ tôm. Rửa khoảng 3 lần là tương đối sạch.
Chú ý
- Vì trước đó ta có bước tẩy màu với H2O2, đây là một chất oxy hóa rất mạnh, khả năng ăn mòn da tay rất nhanh, cần thực hiện các biện pháp an toàn khi tiếp xúc.
Bước 8: Sấy khô
Mục đích
- Làm khô chitin tới một độ ẩm nhất định, thường trên dưới 10%, nhằm ức chế các hoạt động của nấm hay vi khuẩn gây giảm, gây hư hỏng sản phẩm
Tiến hành
- Chitin sau khi rửa sạch để ráo nước, mang cho vào trong tủ sấy, cài đặt ở nhiệt độ dao động từ 50 – 65oC, trong vòng 4 – 6h.
- Nếu thời tiết thuận lợi nhiều nắng, có thể phơi trực tiếp dưới nắng.
- Tiến hành lấy mẩu kiểm tra độ ẩm, đạt điều kiện yêu cầu thì thu sản phẩm.
Chú ý
- Không sấy ở nhiệt độ quá cao, sẽ làm xấu màu sản phẩm.