2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất
Bảng 1 Danh mục nguyên liệu và hóa chất đã sử dụng
Nguyên liệu Hóa chất
- β-Cyclodextrin do Pháp cung cấp - Nicotine do Merck cung cấp
- Sodium alginate, calcium chloride, methanol.
- Nước cất, nước khử ion
2.2.2 Giới thiệu sơ lược về đặc điểm và tính chất của một số nguyên liệu
2.2.2.1 Alginate2,9
Alginate là thuật ngữ được dùng cho muối của alginic acid, những chất bắt nguồn từ alginic acid.
Alginate có trong vách tế bào tảo nâu (Phacophycae) dưới dạng muối calcium, magnesium hoặc sodium của acid alginic. Loại muối calcium và magnesium của alginic thì không tan trong nước. Do đó, phải tách chiết alginate dạng bột khô có thể tan trong nước và loại bỏ những thành phần khác của tảo biển qua quá trình kết tủa.
Alginate là một polysaccharide không có độc tính, dễ phân hủy sinh học. Alginate là copolymer tuyến tính gồm những dãy luân phiên nhau bởi liên kết 1,4 của α-L-guluronic acid và β-D-mannuronic acid.
Alginate được ứng dụng trong phân hủy sinh học, tương hợp sinh học, trong dược phẩm có hoạt tính cao và trong hóa sinh như dẫn truyền thuốc đến các cơ quan mong muốn trong cơ thể và đóng chặt tế bào, được ứng dụng để làm màng nhày.
o Tính chất
Alginate có khả năng tan trong nước tạo thành dạng sền sệt.
Alginate có tính chất keo nên có thể sử dụng để sản xuất những hạt gel bằng cách tập hợp những hạt keo rất nhỏ lại với nhau rồi đem đông đặc trước, sau đó thêm dung dịch polycationic để làm ra chất có trọng lượng phân tử cao, phức tạp làm lớp vỏ phủ bên ngoài cho thuốc.
O OH C O OH O O OH C O O-Na+ OHO O OH C O +Na-O O OH OOH C O O-Na+ O OH +Na-O O
Hình 3 Sodium alginate (C6H7NaO6)n
2.2.2.2 β-Cyclodextrin
β-Cyclodextrin là một trong những cyclodextrin thuộc họ oligosaccharide vòng với lỗ hổng trung tâm ưa chất béo và bề mặt ngoài ưa nước.40,57 Phân tử β-cyclodextrin chứa số lượng hydro cho và nhận tương đối lớn.40 β-Cyclodextrin được mô tả đầu tiên bởi Villiers vào năm 1891.55 Các tên khác thường sử dụng là cyclomylose, cyclomalto oligisaccharide, cyclomaltose hoặc Schardinger dextrin.68
Phân tử β-cyclodextrin chứa bảy đơn vị α-D-glucopyranose được liên kết bằng liên kết α-1,4-glycoside.25,42,44 Cấu trúc của phân tử β-cyclodextrin được trình bày trong Hình 1.40
O OH HO OH O O HO HO OH O O HO OH OH O O HO OH HO O O OH OH HO O O OH HO HO O O OH HO HO O
Hình 4 Cấu trúc hóa học của β-cyclodextrin
o Tính chất
β-Cyclodextrin ổn định về mặt hóa học trong các dung dịch kiềm, dễ bị thủy phân trong điều kiện acid mạnh.16 β-Cyclodextrin ít tan trong nước,5,16,40,57,68 không độc qua đường uống.19,41
Đặc biệt β-cyclodextrin có khả năng tạo phức với nhiều chất16,19,46 nên được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm36 (giảm vị đắng, mùi, hương vị khó chịu và ổn định mùi vị khi lưu trữ lâu dài); công nghiệp dược phẩm40 (làm tăng khả năng hòa tan trong nước của những thuốc có độ hòa tan kém, làm tăng sinh khả dụng và khả năng ổn định của chúng, …); mỹ phẩm,31 vệ sinh cá nhân và đồ dùng vệ sinh19 (ổn định, kiểm soát mùi và cải tiến quy trình khi chuyển đổi của một thành phần chất lỏng thành dạng rắn).40,57
2.3 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG2.3.1 Kính hiển vi điện tử quét74 2.3.1 Kính hiển vi điện tử quét74
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM) là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp (chùm các electron) quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
Hình 5 Máy đo SEM
o Ưu điểm
Mặc dù không thể có độ phân giải tốt như kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng kính hiển vi điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp. Một điểm mạnh khác của SEM là các thao tác điều khiển đơn giản hơn rất nhiều so với TEM khiến cho nó rất dễ sử dụng. Một điều khác là giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế SEM phổ biến hơn rất nhiều so với TEM.
2.3.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua1,2
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy, TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
Hình 6 Kính hiển vi Hitachi H8100 có thế gia tốc 200 kV, nguồn phát electrons LaB6 , độ phân giải tới 0,14 nm
o Ưu điểm
Tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ tương phản, độ phân giải rất cao đồng thời dễ dàng thông dịch các thông tin về cấu trúc. TEM cho ảnh thật của cấu trúc bên trong vật rắn nên đem lại nhiều thông tin hơn, đồng thời rất dễ dàng tạo ra các hình ảnh này ở độ phân giải tới cấp độ nguyên tử. Nhiều phép phân tích rất hữu ích đem lại nhiều thông tin cho nghiên cứu vật liệu.
o Nhược điểm
Giá thành của nó rất cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc cao chẳng hạn chân không siêu cao, sự ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm.
2.3.3 Máy đông khô1
Máy đông khô được xây dựng trên nguyên lý ướp lạnh và làm khô chân không. Máy hoạt động không cần có cả hệ thống nào, chỉ cần nguồn điện ba pha là nó có thể làm việc được, nó làm việc một cách độc lập.
Cấu tạo: Máy đông khô có cấu tạo gọn gàng, buồng khí lạnh và hộp sấy của máy là một khối tổng thể, luồng không khí lạnh giảm nhiệt nhanh và với số lượng lớn. Sự phát tán nguồn nhiệt đồng đều và dễ dàng điều khiển nhiệt độ. Buồng sấy chính được lắp vào khung bảo vệ nhiệt và có thể làm việc tại nhiệt độ ở -40°C.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.4.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine 2.4.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
2.4.1.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp khuấy từ
Phức giữa β-cyclodextrin và nicotine được tổng hợp dựa theo Sơ đồ 1 trình bày ở trang 34.
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa β-cyclodextrin và nicotine đối với hiệu suất tạo phức β-cyclodextrin/nicotine. Sau đó, chọn ra tỷ lệ tốt nhất để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đối với hiệu suất tạo phức.
Sau khi khảo sát thời gian phản ứng, chọn ra thời gian tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất của quá trình tổng hợp phức.
2.4.1.2 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp siêu âm
Tổng hợp phức β-cyclodextrin và nicotine dựa theo Sơ đồ 2 tổng hợp được trình bày ở trang 36.
Khảo sát sự ảnh hưởng của công suất lên hiệu suất tạo phức.
Sau khi khảo sát công suất, chọn ra công suất tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đối với hiệu suất tạo phức.
2.4.2 Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine
Nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine được tổng hợp theo Sơ đồ 3 được trình bày ở trang 38.
Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nicotine đến hiệu suất tổng hợp nano.
2.4.3 Các phương pháp phân tích sản phẩm
Đặc điểm hình dạng, kích thước của phức và các hạt nano đã tổng hợp được xác định bằng cách đo SEM (kính hiển vi điện tử quét), TEM (kính hiển vi điện tử truyền qua). Các mẫu đo SEM và TEM là mẫu sau khi tổng hợp đến giai đoạn tách ly tâm (sau khi rửa lại 3 lần với nước khử ion để loại các hóa chất còn dư).
Bên cạnh đó, sắc ký bản mỏng còn được dùng làm phương pháp định tính nicotine: Chấm trên cùng một bản mỏng dung dịch của nicotine chuẩn và dung dịch của
mẫu phức sau khi đã được sấy khô, dung dịch nicotine chuẩn và mẫu nano sau khi đã đem đông khô (các dung dịch này về phương pháp chuẩn bị được trình bày cụ thể ở trang 59). Sau giải ly bản mỏng được soi dưới đèn UV cho thấy các vết màu tương ứng với từng dung dịch. Sau khi so sánh các vết màu với nhau có thể biết được trong phức β-cyclodextrin/nicotine và nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine có chứa nicotine hay không.
Để xác định hàm lượng nicotine có trong các mẫu nano β-cyclodextrin-alginate–nicotine và trong các mẫu phức β-cyclodextrin/nicotine đã tổng hợp được chúng tôi tiến hành phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký khí GC (phương pháp phân tích được trình bày ở trang 61). Dung dịch nicotine chuẩn và các dịch chiết từ mẫu nano, mẫu phức được phân tích trên máy GC. Để biết được hàm lượng nicotine trong các mẫu đem phân tích so sánh diện tích các peak của dịch chiết từ các mẫu nano với diện tích peak của nicotine chuẩn.
Chương 3
THỰC NGHIỆM
--------
3.1 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Pha chế hóa chất để phục vụ thí nghiệm.
Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp khuấy từ (khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine, thời gian và nhiệt độ phản ứng) và phương pháp siêu âm (khảo sát công suất và thời gian phản ứng).
Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine (khảo sát hàm lượng nicotine).
Pha chế hóa chất để phục vụ thí nghiệm
o Pha chế dung dịch CaCl2 (10,05 mg/mL)
Lấy 5025 mg = 5,025 g CaCl2 hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch CaCl2 (10,05 mg/mL).
o Pha chế dung dịch sodium alginate (9,0 mg/mL)
Lấy 4500 mg = 4,5 g sodium alginate hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch sodium alginate (9,0 mg/mL).
o Pha chế dung dịch β-cyclodextrin (2,4 mg/mL)
Lấy 1200 mg = 1,2 g β-cyclodextrin hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch β-cyclodextrin (2,4 mg/mL).
o Pha chế dung dịch nicotine (10 mg/mL)
Lấy 1 ml = 1,01 g nicotine hòa tan vào 100 mL nước khử ion, ta được 100 mL dung dịch nicotine (10 mg/mL).
3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Các nghiệm thức được bố trí một cách ngẫu nhiên.
3.2.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
3.2.1.1 Phương pháp khuấy từ
Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine đến hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
Thí nghiệm được thực hiện trên 3 nghiệm thức (tương ứng với các tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine là 7,5:1, 7,5:2 và 7,5:3), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine là cao nhất để chụp ảnh SEM.
Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine (Thí nghiệm 1), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các thời gian 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine là cao nhất để chụp ảnh SEM.
Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
Từ kết quả khảo sát thời gian phản ứng (Thí nghiệm 2), chọn thời gian tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các nhiệt độ 30°C, 50°C, 75°C và 100°C), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine là cao nhất để chụp ảnh SEM.
3.2.1.2 Phương pháp siêu âm
Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của công suất đến hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine (Thí nghiệm 1), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 3 nghiệm thức (tương ứng với các công suất mức 1, mức 2 và mức 3), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine là cao nhất để chụp ảnh SEM.
Thí nghiệm 5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
Sau khi khảo sát công suất (Thí nghiệm 4), chọn công suất tối ưu để khảo sát trên 3 nghiệm thức (tương ứng với thời gian phản ứng 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine là cao nhất để chụp ảnh SEM.
3.2.2 Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine
Thí nghiệm 8 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nicotine đến hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate, chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 3 nghiệm thức (tương ứng với các hàm lượng nicotine 10%, 15%, và 20%), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–nicotine là cao nhất để chụp ảnh SEM, TEM.
Xử lý số liệu
Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được đánh giá bằng phần mềm Statgraphics plus, tự động đánh giá độ khác nhau giữa các nghiệm thức với trắc nghiệm bình phương la tinh LSD độ tin cậy là 95,0%.
3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP
3.3.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp khuấytừ từ
Việc hình thành phức β-cyclodextrin/nicotine xảy ra trong pha nước không có sử dụng những chất độc hại.
o Quy trình tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine
Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp khuấy từ
o Các bước tiến hành tổng hợp
β-Cyclodextrin được hòa tan trong nước khử ion ở 100°C. Nicotine được thêm vào, hỗn hợp này được khuấy trong thời gian 4 giờ ở 75°C (Hình 7).
Để mẫu qua đêm, sau đó lọc hút chân không. Đem mẫu này sấy khô thường ở 35°C. Kết quả thu được sản phẩm là chất rắn màu trắng hơi ngà vàng.
Phức β-cyclodextrin/nicotine Nicotine, khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine β-Cyclodextrin, khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine Nước khử ion (75°C)
Khuấy từ, khảo sát thời gian phản ứng, khảo sát nhiệt độ phản ứng
Lọc hút chân không Sấy thường 35°C
Hình 7 Phức β-cyclodextrin/nicotine kết tủa
- Thời gian và nhiệt độ được giữ không đổi, thay đổi tỷ lệ giữa nicotine và β-cyclodextrin để khảo sát sự ảnh hưởng của nó đến hiệu suất tổng hợp phức. Tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine được khảo sát là 7,5:1, 7,5:2 và 7,5:3.
- Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine, chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đối với hiệu suất tạo phức. Thời gian phản ứng được khảo sát là 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ. Nhiệt độ được giữ không đổi.
- Từ kết quả khảo sát thời gian phản ứng, chọn thời gian tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu suất tạo phức. Phản ứng được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau 30°C, 50°C, 75°C và 100°C. Tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine được giữ cố định.
3.3.2 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp siêu âm
Sơ đồ 2 Quy trình tổng hợp phức β-cyclodextrin/nicotine bằng phương pháp siêu âm
o Các bước tiến hành tổng hợp
β-Cyclodextrin được hòa tan trong nước khử ion trong bồn siêu âm. Nicotine được thêm vào, hỗn hợp này được siêu âm (Hình 8) ở các công suất khác nhau trong thời gian 4 giờ.
β-Cyclodextrin
Bồn siêu âm khảo sát công suất, khảo sát thời gian phản ứng
Phức β-cyclodextrin/nicotine
Nicotine Nước khử ion (75°C)
Để mẫu qua đêm Lọc hút chân không
Hình 8 Hỗn hợp β-cyclodextrin và nicotine trong bồn siêu âm
Để mẫu qua đêm, sau đó lọc hút chân không thu kết tủa. Đem mẫu này sấy khô thường ở 35°C. Sản phẩm là chất rắn màu trắng hơi ngà vàng.
- Hỗn hợp nicotine và β-cyclodextrin (tỷ lệ β-cyclodextrin:nicotine được giữ cố định) được cho phản ứng trong bồn siêu âm ở các công suất mức 1, mức 2 và mức 3.
- Từ kết quả khảo sát công suất, chọn công suất tối ưu để khảo sát thời gian.