Chương 2.
T Ổ N G QUAN V Ể T Â C H VĂ XÂC Đ ỊN H D IO X IN
Vì mức độ độc cực kỳ cao của một số đồng phđn của PCDD vă PCDF, do vậy cần phải có câc phương phâp xâc định đặc biệt với độ chọn lọc cao. Mức độ phât hiện Dioxin trong câc mẫu sinh học vă mẫu lấy từ người phải đạt được giâ trị thấp hơn nhiều so với mức cần thiết để phât hiện thuốc trừ sđu. Mức xâc định
1 picrogam (lpg = 10-12g) hoặc bĩ hơn lpg trong 1 gam mẫu lă mức cần thiết để phât hiện 2378-TCDD vă câc đồng phđn khâc. Việc phđn tích sẽ bị phức tạp lín rất nhiều khi có vô số câc chất gđy cản trở có mặt trong mẫu. Bín cạnh đó, sự phức tạp trong quâ trình phđn tích còn bị gđy ra bởi số lớn câc đồng phđn của Dioxin vă furan với câc biến đổi độ độc, hiệu lực sinh học khâc nhau cùng có mặt trong mẫu phđn tích.
Ngăy nay phđn tích Dioxin vă furan không chỉ dùng lại ở phđn tích thăn dò, mă còn phục vụ cho nghiín cứu y học vă giải quyết câc vấn đề về môi trường. Do vậy đòi hỏi phải có qui trình chuẩn bị mẫu đơn giản, đỡ tốn kĩm, vă nhanh chóng trả lời kết quả.
2.1. Một số phương phâp tâch Dioxin điển hình
+ Stalling vă câc cộng sự đê đưa ra phương phâp chiết vă lăm giău PCDD hoặc PCDF cần phđn tích ở trong mô mỡ câ. Phương phâp năy cũng được âp dụng cho câc mẫu khâc như câc mẫu trầm tích vă mô mỡ của người. Với phương phâp năy mô mỡ câ (lOOg) được trộn đồng nhất với Na2S04 khan. Dịch chiết mẫu đưa văo hệ thống cột sắc ký đầu tiín chứa hai phđn đoạn: phđn đoạn chứa kalisilicat vă phđn đoạn chứa silicagen; sau đó dịch được đưa văo hệ cột có chứa xerisilicat vă silicagen; sau hệ cột năy lă hệ cột có chứa cacbon phđn tân trín sợi bông thuỷ tinh. Cột cacbon đầu hấp thụ hầu hết câc cấu tử đa vòng chứa clo vă không chứa clo, ở cột năy câc đồng phđn PCDD vă PCDF, sẽ được giữ lại. Cùng với một số chất tương tự câc đồng phđn PCDD vă PCDF được rửa giải ra khỏi cột câcbon, khi tiến hănh rửa giải cột ngược trở lại dòng chảy ban đầu bằng dung môi toluen. Dịch rửa giải thu được cho dung môi bay hơi chậm đến khô, hoă tan mẫu trở lại trong n-Hexan vă đưa văo lăm sạch tiếp trín hai cột. Cột thứ nhất: phía trín cột nhồi silicagen tẩm axit sunfuric ở hai nồng độ khâc nhau vă phía dưới cột nhồi xerisilicat. Dich rửa giải ở cột thứ nhất được đưa văo cột thứ hai chứa A120 3. Cần lưu ý, trước khi lăm sạch mẫu trín câc cột chứa hỗn hợp câc
muối phải cho văo đó một lượng xâc định chất chuẩn có gắn đồng vị phóng xạ
1 *c hoạc 37C1 của 2378-TCDD, 2378-TCDF vă OCDD.
+ Langhorst vă cộng sự đưa ra phương phâp chiết vă lăm giău PCDD vă PCDF trong sữa mẹ. 30g sữa của phụ nữ mói sinh (được trộn cho đến khi đồng nhất) cho văo bình thuỷ tinh sạch vă cho văo đó một lượng xâc định 5ng câc chất chuẩn - chất đồng vị của chất cần tìm, 200ml axit H G đậm đặc, lắc trín mây lgiờ, thím 100ml hexan văo bình rồi lắc trín mây ở nhiệt độ phòng. Kết thúc thời gian trín, để hỗn hợp yín tĩnh trong vồng 5 phút đến khi phđn lớp. Lấy lớp dung môi hữu cơ chuyển văo hệ cột sau: Hệ cột thứ nhất: Cột đầu chứa 2 phđn đoạn-phđn đoạn silicagen, phđn đoạn silicagen được tẩm 22% H2S 04 đậm đặc; cột sau chứa 5 phđn đoạn-phđn đoạn silicagen, phđn đoạn silicagen được tẩm 44% axit H2S04 đậm đặc, phđn đoạn silicagen, phđn đoạn silicagen tẩm 33% dung dịch NaOH IN, phđn đoạn silicagen. Tiếp sau hệ cột thứ nhất lă hệ cột thứ hai: cột đầu chứa 10% AgN03 trín silicagen; cột sau chứa A120 3.
Kết thúc quâ trình trín lă bước tâch hỗn hợp thănh câc phđn đoạn hẹp nhờ phương phâp sắc ký lỏng cao âp (HPLC) pha thường vă pha ngược, chất nhồi cột dùng ở đđy lă Zorbax-ODS hoặc Zorbax Sil.
+ Rappe vă câc cộng sự đưa ra phương phâp chiết vă lăm giău PCDD vă PCDF trong mâu. Nguyín tắc chiết, lăm sạch mẫu mâu dựa trín sự phđn bố câc đồng phđn đioxin giữa hexan vă axetonitril. Hexan được cho văo lOml mâu. Mâu được cho văo một lượng 0,1 ng chất chuẩn 13C-2378-TCDD, chiết mẫu 3 lần, mỗi lần bằng văi chục ml axetonitril / hexan,sau đó ly tđm. Tổ hợp câc dịch chiết lại để xử lý với 10ml dung dịch Na2S04. Tổ hợp dịch chiết hexan lại, lăm khô chúng bằng Na2S04 khan. Cô đặc dịch chiết còn 2ml, mẫu xử lý trín cột A1203 được rửa giải bằng hỗn hợp CH2C12/Hexan. Dịch rửa giải lần đầu loại bỏ, còn dịch rửa giải lần sau được cô đặc vă được phđn tích trín GC/MS.
+ Lamparski vă câc cộng sự đưa ra phương phâp phđn tích PCDD vă PCDF trong đất vă nước. Phương phâp năy sử dụng bezen để chiết soxhlet mẫu đất,vă câc bước lăm sạch trín cột sắc ký giống phương phâp của Langhorst đê níu ở trín.
+ Phòng thí nghiệm AXYS -Canada, 1995 đê đưa ra câc phương phâp tổng hợp tâch chiết dioxin trong câc đối tượng khâc nhau. Trong đó đâng chú ý lă phương phâp chiết dioxin bằng hỗn hợp Etanol - Kiềm. Phương phâp được sử dụng để chiết Dioxin chủ yếu trong câc mẫu sinh học. Câc bước lăm sạch mẫu gần giống như phương phâp của Lamparski vă câc cộng sự.
2.2. Câc chất ảnh hưởng đến quâ trình tâch vă xâc định Dioxin
Đối với câc mẫu đất vă trầm tích câc hợp chất chưa lưu huỳnh, câc chất humíc, câc chất DDT, DDE, DDD, PCBs,... sẽ gđy ảnh hưởn đến kết quả phđn tích Dioxin nếu chúng không được loại bỏ ra khỏi mẫu trước khi phđn tích trín GC/MS hoặc GC/ECD.
Câc chất humic lă câc chất không bị phđn huỷ. Nó được hình thănh trong quâ trình phđn huỷ sinh học câc thực vật thối rữa. Khi sử dụng dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp Etanol - Kiềm để chiết dioxin thì dịch chiết thu được có chứa một lượng lớn chất humic, bao gồm humin tan, humic axít, fuvic axít.
Axit humic vă axit fuvic không phải lă câc chất đơn phđn tử, câc chất năy có phđn tử lớn, đa phđn tử, đa điện tích. Trọng lượng phđn tử khoảng văi trăm (axit fuvic) tới hăng chục nghìn (humic axit vă humin). Phđn tử của chúng bao gồm bộ khung cacbon với số lượng lớn câc vòng thơm vă số lớn câc nhóm hoạt động chứa oxy.
Khi humic axit bị phđn huỷ thì câc sản phẩm phđn huỷ đặc trưng của chúng có chứa câc vòng thơm vă chứa câc nhóm phđn cực như: nhóm hydroxyl, nhóm cacboxyl. Do vậy loại bỏ chất năy ra khỏi mẫu không phải lă việc lăm đơn giản.
2.3. Văi nĩt về phương phâp xâc định Dioxin
Trong câc năm gần đđy nhiều phương phâp chuẩn bị mẫu đê được phât triển nhằm phđn tích lượng vết PCDD vă PCDF trong câc mẫu môi trường; đặc biệt phương phâp phđn tích đặc trung đối với câc đồng phđn độc nhất 2378- TCDD cũng đê được phât triển. Nĩt đặc trung nhất của câc phương phâp phđn tích lă dựa trín phổ khối lượng. Điều kiện cần đầu tiín để cho kết quả phđn tích chính xâc lă mẫu phải được lấy đặc trưng, phải được bảo quản tốt, việc chiết mẫu phải cho hiệu quả cao; phĩp tinh chế mẫu (lăm sạch, lăm giău mẫu) căng đơn giản căng tốt. Một số băi bâo đê thảo luận câc phương phâp phđn tích PCDD vă PCDF khâc nhau. Hầu hết câc phương phâp cũ đê được đưa ra thảo luận vă được xem xĩt lại. Tuy nhiín, đê có một số phương phâp đưa ra hiện nay như phương phâp của Kiney, 1978; Rappe vă Buser, 1981; Esposito vă câc cộng sự, 1980; Karasek vă Onuska, 1982; Tieman, 1983 đê được âp dụng để phđn tích xâc định PCDD vă PCDF. Ngăy nay trín thế giới đê có một số phòng thí nghiệm phđn tích dioxin chuẩn, như ở Canada, Mỹ, Nhật. Mỗi phòng thí nghiệm có một phương phâp phđn tích riíng.
Phương phâp phđn tích Dioxin phât triển hết sức nhanh chóng, hiện nay người ta có thể xâc định được dioxin ở trong nước với mức 10.10-15g/g, vă phđn tích Dioxỉn ở mức 0,01pg/g trong môi trường đất, không khí vă mẫu sinh học.
Việc tâch câc đồng phđn của dioxin vă furan thănh câc píc riíng rẽ trín sắc đổ vă trín phổ khối đồ đến nay đê thực hiện được, điều đó cho phĩp xâc định được chính xâc hăm ỉượng của chất cố trong mẫu.
Hiện nay của thế giới lă xđy dựng câc phòng thí nghiệm phđn tích Dioxin mang tính chất Quốc tế nhằm đânh giâ một câch đúng đắn vă khâch quan về số liệu phđn tích.
Hỗn hợp câc đồng phđn của dioxin vă furan trong bảng 2 được dùng để kiểm tra câc phòng thí nghiệm phđn tích Dioxin năy. Đđy cũng lă 17 đồng phđn độc nhất của dioxin vă furan.
Qua câc lần khảo sât người ta thấy rằng câc kết quả nhận được của câc phòng thí nghiệm năy không trùng nhau. Đối với mỗi đồng phđn độ lệch chuẩn tương đối khi so sânh kết quả giữa câc phòng thí nghiệm với nhau (dùng phĩp phđn tích đặc trưng) thường nhỏ hơn 5%. Độ lệch chuẩn tương đối so với câc giâ trị trung bình của câc phòng thí nghiệm thường nhỏ hơn 10%.
Bảng 2: Hỗn hợp câc đồng phđn của dioxin vă fu r an dùng để kiểm tra câc phòng thí nghiệm phđn tích Dioxin
Câc Dibenzo-p-dioxin Câc Dibenzofuran
2378 - TCDD 2378 - TCDF 12378 - PCDD 12378 - PCDF 123478 - HCDD 23478 - PCDF 123678 - HCDD 123478 - HCDF 123789-HCDD 123678 - HCDF 1234678 - HpCDD 123789 - HCDF 12346789 - OCDD 234678 - HCDF 1234678 - HpCDF 1234789-HpCDF 12346789 - OCDF
Phđn tích Dioxin do phải dùng hệ thống sắc ký khí khối phổ phđn giải cao (GC/MS) vă câc hoâ chất đắt tiền cho nín chi phí cho một mẫu phđn tích thường rất cao. Để giảm bớt chi phí phđn tích mẫu, đồng thời để phđn tích Dioxin được phât triển rộng rêi ờ câc phòng thí nghiệm không có hệ thống GC/MS, người ta nghiín cứu xđy dụng phương phâp phđn tích dioxin trín hệ thống sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử (GC/ECD) từ những năm 80. Tuy nhiín, việc sử dụng phương phâp GC/ECD mă câc tâc giả Niemann chỉ mang tính chất bân định lượng.
2.4. Tổng quât chung về câc bước xâc định Dioxin
2.4.1. Chiết mẫu
Phương phâp chiết soxhlet, phương phâp chiết với hỗn hợp kiềm - etanol vă phương phâp chiết pha rắn.
2.4.2. Lăm sạch mẫu
PCDD vă PCDF hiện nay đê được tìm thấy trong câc sản phẩm công nghiệp vă trong câc mẫu môi trường khâc nhau, chẳng hạn: mâu, mô mỡ lấy ở người, mỡ câ, mỡ chó biển, mỡ bò, mỡ hươu, trúng chim vă câc trầm tích, đất, tro bay vă câc sản phẩm khâc từ câc lò đốt râc hoặc quâ trình đốt chây khâc. Câc phương phâp lăm sạch mẫu đê công bố có nhiều điểm khâc nhau đối với mỗi loại mẫu.
2.4.3. Xâc định Dioxin
2.4.3.1. Tâch câc đồng phđn
Sau khi mẫu được tâch chiết vă lăm sạch sẽ được tiến hănh phđn tích trín hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC/MS) hoặc hệ thống sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử (GC/ECD). Dựa văo khả năng phđn tâch cao của cột sắc ký khí mao quản tẩm câc loại pha tĩnh khâc nhau để phđn tích tính định tính, định lượng câc đồng phđn Dioxin. Câc cột mao quản được tẩm câc pha tĩnh sau đđy để tâch câc đồng phđn dioxin: Silar 10C, SP 2330, SP 2331, SP 2340, OV-1701, SE 54, BD-5 hoặc OV-lOl. Mây khối phổ được vận hănh theo chế độ va chạm electron (EI) hoặc theo chế độ ion hoâ chất thănh đm tính (NCI).
Để xâc định câc đồng phđn dioxin một câch rõ nhất thì câc đồng phđn phải được tâch riíng khỏi câc tạp chất như DDT, DDE, DDD, PCBs, Humic,....VỚi cột mao quản 55m tẩm Silar 10C, đồng phđn độc nhất 2378- TCDD được tâch khỏi 21 đồng phđn khâc. Câc cột mao quản sau đđy thường được dùng để phđn tích dioxin: OV-1701, SP 2331, BD-5, HP-5. Đối với cột SP
2331 được dùng để phđn tích dioxin nhiều nhất, tuy nhiín do cột lăm việc ở nhiệt độ thấp cho nín cột dễ bị nhiễm bẩn.
Trín khối phổ đồ nhận được khi sử dụng câc cột đê níu đồng phđn 1378- TCDD luồn luôn được tâch riíng rẽ vă tâch xa câc đồng phđn khâc; đồng phđn 1234-TCDD luôn luôn lă đồng phđn rửa giải sât ngay bín cạnh 2378-TCDD.
2A.3.2. Định tính vă định lượng
Định tính Dioxin theo phương phâp GC/MS chủ yếu dựa văo thời gian xuất hiện pic của Dioxin trùng với thời gian xuất hiện pic của Dioxin có gắn đồng vị phóng xạ, còn phương phâp GC/ECD dựa văo thời gian lưu biết trước của Dioxin chuẩn khi phđn tích trong cùng điều kiện. Mây sắc ký khí hiện đại cho phĩp xâc định chính xâc thời gian ỉưu của câc đồng phđn dioxin, sai số thời gian
ỉưu giữa câc lần bơm mẫu lă rất nhỏ.
Phổ khối phđn tử của câc đồng phđn PCDD vă PCDF trong câc mẫu thường sử dụng lă câc mảnh phổ M+, M**2 hoặc M++4. Phương phâp GC/MS có thể thực hiện ghi nhận phổ ở nhiều mức năng lượng ion hoâ khâc nhau 20eV, 70eV,... . Thưòng người ta sử dụng mức năng lượng ion hoâ bằng 70eV. Trong điều kiện phđn tích khồng đổi với E = 70eV, người ta thấy câc phđn tử có cấu tạo tương tự nhau sẽ phâ vỡ theo kiểu giống nhau.
Việc định lượng câc đồng phđn PCDD vă PCDF được dựa văo số đo diện tích của mỗi đồng phđn hoặc so với số đo diện tích cũng của đồng phđn tương ứng có gắn đồng vị phóng xạ 37C1 hoặc 13c trín khối phổ đồ hoặc so sânh giân tiếp diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mỗi đồng phđn vơí đường ngoại chuẩn xđy dựng từ chính đồng phđn năy ở dạng tinh khiết.
Để trânh những sai lầm trong kết luận mẫu có dioxin hay không vă hăm lượng của nó lă bao nhiíu người ta thường sử dụng tỷ số túi hiệu chất : nhiễu đường nền - đđy được coi như lă giâ trị giới hạn phât hiện của phương phâp. Tỉ số năy thường dùng lă 2,5 đối với câc phĩp phđn tích có giới hạn phât hiện lă lppt, còn câc phương phâp có giới hạn phât hiện lă 0, lppt thì tỷ số năy lă 3.
Trọng lượng mẫu, kích thước mẫu, phần trăm chất thu hồi được khi xử lý mẫu, độ phức tạp của mẫu, độ nhiễm điện xuất hiện lúc đo đều ảnh hưởng đến giới hạn xâc định định lượng.
Do những phương phâp phđn tích dioxin được xđy dựng công phu trín hệ thống GC/MS đắt tiền, người ta đê nghĩ tới việc xđy dựng phương phâp phđn tích dioxin rẻ tiền nhưng vẫn hữu hiệu, đó lă phương phâp phđn tích dioxin trín hệ
GC/ECD. Bín cạnh mục đích sử dụng phương phâp GC/ECD để nghiín cứu tâch câc đổng phđn TCDD, người ta sử dụng phương phâp GC/ECD để định lượng câc đòng phđn TCDD.
So sânh phương phâp GC/MS với phương phâp GC/ECD thì phương phâp GC/ECD có độ nhậy lớn hơn hẳn phương phâp GC/MS, do vậy phương phâp GC/ECD cho phĩp xâc định được 2378-TCDD ở mức độ ppt. Giới hạn của phương phâp GC/ECD khi phần tích đioxin lă giâ trị nhỏ hơn 2,7ppt thì chỉ cho kết luận định tính, còn giâ trị 5,4 ppt hoặc lớn hơn thì cho phĩp kết luận định lượng. Ngoăi hạn chế nói trín phương phâp GC/ECD còn bộc lộ yếu điểm lă phải dùng phương phâp GC/MS để xâc định lại 2378-TCDD.
2.4.4. Phđn tích vă xâc định Dioxin ở Việt Nam
Hiện nay ở Việt nam có một số phòng thí nghiệm phđn tích Dioxin nằm ở câc trường đại học, câc viện nghiín cứu, như Phòng thí nghiệm thuộc Khoa hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiín, ĐHQGHN, Phòng thí nghiệm thuộc Trung tđm Giâo dục vă phât triển sắc ký, Đại học Bâch khoa Hă Nội, Phòng thí nghiệm thuộc Trung tđm Nhiệt Đới Việt Nga, Phòng thí nghiệm thuộc Ban 10- 80, Bộ Y tế, Phòng thí nghiệm thuộc Trung tđm Dịch vụ phđn tích, Thănh phố Hồ Chí Minh.
Câc phòng thí nghiệm năy có trình độ chuyín môn sđu khâc nhau vă được