QUI TRÌNH TỔNG HỢP PEPTIDE TRÊN PHA RẮN
3.2.5 Cô lập và tinh khiết peptide
• Peptide thô tách khỏi chất mang được sắc kí qua cột Dowex 50-X4 với dung môi giải ly là đệm pyridine acetate 0,1 M pH = 4.
• Các sản phẩm phụ như dipeptide và tripeptide tuy chỉ chiếm lượng nhỏ (20 mg và 33 mg) nhưng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp, chúng cần được tách ra khỏi tetrapeptide bằng sắc kí.
Đánh giá độ tinh khiết của tetrapeptide bằng các bước sau:
• (1) Sắc ký cột Dowex 50 cho một mũi đơn duy nhất. • (2) Cho một mũi đơn đối xứng giống như tính toán.
• (3) Sắc ký giấy cho một vết với ba hệ dung môi khác nhau.
• (4) Tỷ lệ các amino acid được xác định thông qua phân tích định lượng là leucine 1.00, alanine 1.00, glycine 0.99, valine 1.00.
• (5) Độ tinh khiết quang học được xác định thông qua sự thủy phân với hai enzyme. Leucine aminopeptidase thủy phân peptide cho biết độ tinh khiết của L-leucine và L-alanine (Bảng II). Carboxypeptidase thủy phân L-valine cho biết độ tinh khiết của amino acid này.
• (6) Cuối cùng là so sánh sắc ký, độ quay quang học, phổ hồng ngoại với chất chuẩn.
KẾT LUẬN
- Tổng hợp peptide trên pha rắn (SPPS) được Robert Bruce Merrifield nghiên cứu đầu tiên đã làm thay đổi mạnh mẽ mô hình tổng hợp peptide theo hướng mới.
- Ngày nay, SPPS là phương pháp được chấp nhận cho việc tạo ra các peptide và protein trong phòng thí nghiệm.
- Kể từ khi được đề cập đến lần đầu tiên cách đây hơn 40 năm, SPPS đã được phát triển đến mức gần như hoàn thiện.
+ Trước hết là việc hoàn thiện khả năng của các chất
mang, trong đó cầu nối giữa carbon cuối mạch của amino acid và nhựa polystyren đã được cải tiến để khi gắn vào hay tách ra đều thu được các sản phẩm có hiệu suất cao.
+ Việc cải tiến các nhóm chức phụ trong các nhóm bảo vệ cũng đã hạn chế nhiều phản ứng phụ không mong muốn xảy ra.
+ Thêm vào đó, việc phát triển thêm các nhóm bảo vệ mới dựa trên nhóm carbonyl trong các amino acid thế cũng đã được cải tiến để phản ứng ghép cặp xảy ra và hạn chế sự epimer hóa.
Mỗi sự cải tiến này đều góp phần làm cho SPPS trở thành một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi đến tận ngày nay.