phân protein bằng enzyme protease
4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nước mắm và sự thủy phân protein bằng enzyme proteaza protein bằng enzyme proteaza
4.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nước mắm Vai trò của enzyme proteaza trong sản xuất nước mắm Vai trò của enzyme proteaza trong sản xuất nước mắm
Enzyme thủy phân nội tại trong các loại cá có nguồn gốc từ cơ quan nội tạng hoặc mô cơ. Các thuộc tính và hoạt động của các enzym nội tại tùy thuộc vào loài cá [18] và mùa đánh bắt cá [34].
Tác dụng của enzym tiêu hóa trong quá trình lên men nước mắm được nghiên cứu bởi Uyenco và các cộng sự. Họ kết luận rằng enzyme tiêu hóa là tác nhân chính trong quá trình phân giải protein tạo nên sự khác biệt trong hàm lượng axit amin của sản phẩm cuối cùng [67].
Simpson và Haard phát hiện ra việc loại bỏ các nội tạng cá trích trước khi lên men sẽ làm giảm sự hình thành của peptide và các axit amin trong dịch nước mắm [62].
Raksakulthai quan sát thấy rằng các enzyme tiêu hóa đóng góp tích cực trong quá trình lên men nước mắm, vì tốc độ thủy phân protein của cá nguyên con cao hơn đáng kể so với cá đã moi nội tạng. Tuy nhiên, chất lượng cảm quan của nước mắm sản xuất từ cá nguyên con hoặc cá đã moi nội tạng không có sự khác biệt rõ rệt [55].
Orejana và Liston nghiên cứu các enzyme phân giải protein trong quá trình sản xuất nước mắm Philippines. Họ báo cáo rằng, enzyme Tripsin hoạt động mạnh trong vài ngày đầu của quá trình lên men. Trong tháng đầu tiên enzyme hoạt động tối đa, sau đó bị suy giảm và duy trì hoạt động ở mức thấp trong suốt quá trình lên men còn lại [51].
Vo và cộng sự báo cáo rằng hoạt động của aminopeptidase trong nước mắm sản xuất từ cá mòi là khá ổn định. Trong 2 tháng đầu của quá trình lên men, hoạt động của aminopeptidase mạnh, sau đó hoạt động của nó dần dần yếu đi. Cũng trong năm này Vo Van và cộng sự quan sát thấy rằng hoạt tính của
Cacboxypeptidase gần như biến mất hòa toàn sau vài ngày đầu của quá trình lên
men nước mắm từ cá mòi. Họ kết luận rằng enzyme này không đóng vai trò chính trong quá trình thủy phân protein cá thành các acid amin tự do và các peptit trong nước mắm [68].
Các enzyme cathepsin, peptidase, transaminase, amidases, aminoacid
decarboxydase có trong cơ thịt cá, chúng có thể đóng vai trò quan trọng trong
quá trình lên men của nước mắm, đặc biệt là cathepsin [63].
Rosario và Maldo, nghiên cứu hoạt động của cathepsins trong quá trình lên men của nước mắm Philippine. Kết quả nghiên cứu cho thấy: trong quá trình lên men, Cathepsin A và C là quan trọng trong sự phân giải protein. Hoạt động
của Cathepsin A tỷ lệ thuận vào số lượng của acid amin được tạo ra trong khi
hoạt động của Cathepsin C tỷ lệ thuận với số lượng peptit có trọng lượng phân tử thấp trong nước mắm [56].
Mặc dù các vi sinh vật trong nước mắm không đóng một vai trò quan trọng, nhưng các enzym từ những vi sinh vật này có thể đóng góp cho sự thủy phân protein trong quá trình lên men nước mắm [18, 59].
Sự hình thành các chất có đạm trong quá trình lên men nước mắm
Trong quá trình thủy phân protein, hàm lượng nitơ axit amin tăng dần lên cho đến 4-5 tháng [67]. Các thành phần đạm hòa tan đã được chuyển đổi thành các axit amin và amoniac.
Các nghiên cứu về nước mắm Thái Lan của Kasemsarn và Saïsithi cho thấy nitơ hòa tan tăng trong suốt quá trình lên men, nitơ ammoniac tăng trong 6 tháng đầu tiên và sau đó vẫn không thay đổi trong suốt qua trình lên men [35, 59].
Sự thay đổi trong quá trình thủy phân protein chủ yếu trong vài tháng đầu tiên của quá trình lên men nước mắm, trong thời gian này đã có sự thay đổi về lượng nitơ amin, protein hòa tan, sự tăng lên của axit amin và các peptit [49]. Amoniac và các thành phần bay hơi khác tăng lên trong suốt quá trình lên men.
Orejana cho rằng thời gian của quá trình lên men không nên kéo dài sau 5 tháng, vì khi lên men vượt thời gian này sẽ làm tăng cường sự thủy phân axit amin thành ammoniac làm giảm chất lượng dinh dưỡng của nước mắm [49].
Nitơ trong nước mắm bao gồm chủ yếu là nitơ của các peptide và acid amin. Phạm vi trọng lượng phân tử peptide được hình thành trong thời gian 40 ngày đầu tiên của quá trình lên men dao động từ 700 – 1500 dalton [51]. Trong thời gian 40 ngày đầu tiên của quá trình lên men, enzyme endopeptidases
Trypsin là hoạt động tích cực nhất. Trong giai đoạn 70 đến 140 ngày các peptit có
trọng lượng phân tử thấp tăng lên đáng kể, điều này chỉ ra rằng enzyme exopeptitdase hoạt động mạnh hơn ở giai đoạn này [50].
Nghiên cứu về vi sinh vật trong nước mắm
Một loạt các vi sinh vật đã được tìm thấy trong nước mắm. Các loại vi sinh vật có thể có và các nguồn vi sinh vật tham gia trong quá trình lên men nước mắm đã được Orejana tóm tắt
Các vi sinh vật tự nhiên có mặt trong cá chủ yếu là: pseudomonas và
Achromobacter.
Vi sinh vật liên quan đến nước và môi trường: Clostridium và Escherichia
Các vi sinh vật có ở muối biển và các phụ gia khác, ví dụ: Bacillus, Halobacterium và Micrococcus.
Saisithi và cộng sự nghiên cứu sự biến đổi của vi sinh vật trong quá trình lên men nước mắm Thái Lan (Nampla). Họ đã phân lập được 10 loài Bacillus, 1 loài coryneform, 2 loài Streptococcus và Micrococcus, 1 loài Staghylococcus [60].
Crisan và Sands nghiên cứu hệ vi khuẩn 4 loại nước mắm: Nampla, Patis, Koami, Onago,và đã phân lập được 11 loài vi khuẩn, 1 loài nấm men và 3 loài nấm sợi. Phân lập từ Nampla ở các thời gian lên men khác nhau chủ yếu gồm có các loài bacillus, trong khi nấm men, nấm sợi và vi khuẩn kị khí không được phân lập. Trong Patis, vi sinh vật phân lập được chủ yếu bao gồm loài Bacillus,
Micrococcus và nấm men Candida clausenic. Koami một loại nước mắm được
sản xuất từ tôm có loài Bacillus và chủng Penicilliumnotatum. Trong Onago một sản phẩm nước mắm Nhật có mặt Bacillus, và hai loại nấm mốc Cladosporium
herbarum và Aspergillus fumigatus. Crisan và Sand đã cho thấy loài trực khuẩn là những vi sinh vật chiếm ưu thế trong nước mắm [24].
Sanceda và cộng sự đã nghiên cứu về thay đổi của các vi sinh vật trong nước mắm philippine (Patis). Vi khuẩn chiếm ưu thế trong suốt thời gian lên men là các loài Bacillus.Coagulans, Bacillus megatarium, Bacillus Subtilis được tìm thấy trong giai đoạn đầu, trong khi Bacillus licheniformis, Micrococcus
Colpogenes và Staphylococcus epidermio đã được tìm thấy trong giai đoạn giữa
của quá trình lên men. Các vi sinh vật chiếm ưu thế ở giai đoạn cuối của quá trình lên men chủ yếu là các chủng kháng muối: Micrococcus roseus,
Micrococcus varians và Staphylococcus Saprophyticus [57].
Fujii và Saikai đã báo cáo rằng các vi sinh vật chủ đạo dược phân lập từ nước mắm Nhật Bản (Shotturu) là Vibrio và các loài Bacillus trong môi trường có chứa NaCl 2,5%. Tuy nhiên khi muối được tăng lên 20% Halobacterium,
Bacillus chiếm ưu thế [26].
Năm 1982, Ok và cộng sự nghiên cứu sự hình thành protease của một chủng Bacillus ưa mặn được phân lập từ nước mắm Trung Quốc và Myanma. Các vi khuẩn phân lập được, có khả năng tăng trưởng trong môi trường có chứa NaCl 4M. Độ pH và nhiệt độ thích hợp cho việc sản xuất enzyme là: pH = 7 và 44 oC có nghĩa là tương tự như các điều kiện lên men cho nước mắm ở khu vực Đông Nam Á [47].
Người ta tin rằng các vi sinh vật không đóng vai trò chính trong sự thủy phân protein cá vì số lượng của chúng giảm đều đặn trong quá trình lên men [29, 60, 50]. Tuy nhiên, chúng đóng vai trò cho sự phát triển hương thơm của nước mắm.
Beddows và cộng sự báo cáo rằng khi cá tươi và muối được trộn với nhau và được lên men mà không có bất kỳ thời gian nào trải qua trước khi ướp muối thì ít có các acid béo bay hơi được hình thành, đặc biệt là: n-butyric acid [19, 20]. Sanceda và cộng sự từ các nghiên cứu về cá, có muối hoặc không có muối đã kết luận rằng: vi khuẩn có tham gia vào sự hình thành của các acid dễ bay hơi vì hầu hết các acid đạt hàm lượng rất cao trong cá được ủ mà không có muối [58].
Nghiên cứu đẩy mạnh quá trình lên men
Sản xuất nước mắm truyền thống, chủ yếu dựa vào quá trình tự phân giải protein dưới tác dụng của enzyme protease trong cơ thể cá. Phương pháp này rất
tốn thời gian (6 - 12 tháng), và cần phải có sức chứa bảo quản lớn, không kinh tế. Để giảm bớt vốn đầu tư, người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu để thúc đẩy quá trình lên men, rút ngắn thời gian sản xuất bao gồm: tăng nhiệt độ lên men, sử dụng axit, thủy phân bằng kiềm, bổ sung enzyme, sử dụng vi khuẩn và enzyme của chúng…
Gildberg và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất nước mắm từ cá cơm
(Stolephorus sp.) trong vòng 2 tháng bằng cách (điều chỉnh pH = 4) sử dụng axit
acetic và hydrochloric và làm giảm hàm lượng muối 5% đến 15% [27].
Tăng nhiệt độ lên men:
Khi tăng nhiệt độ lên men của nước mắm thì tốc độ thủy phân protein thành acid amin tăng. Tuy nhiên nhiệt độ chỉ có thể tăng lên 37 – 45 °C. Vì nhiệt độ cao hơn sẽ làm biến tính enzyme thủy phân protein, và làm tiêu hao năng lượng nếu thời gian gia nhiệt kéo dài.
Orejana báo cáo rằng hàm lượng acid amin tự do có được trong nước mắm sau 14 tháng lên men ở nhiệt độ phòng (23 °C) có thể đạt được chỉ sau một tháng lên men ở nhiệt độ 37 °C [49].
Miyazawa và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên nước mắm sản xuất từ cá cơm. Họ thấy rằng tỷ lệ phần trăm protein thủy phân sau 150 ngày là: 25,3%; 17,6%; 6,3%; 2,9% protein tổng ở 50 °C; 30 °C; 10 °C; 2 °C [40].
Ooshiro và cộng sự so sánh nước mắm lên men ở nhiệt độ phòng (24 oC) với nước mắm lên men ở nhiệt độ 37 °C và 50 °C. Họ quan sát thấy rằng, lúc đầu, nồng độ của các acid amin và nitơ hòa tan trong mẫu 37 °C cao hơn so với mẫu tại nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, sau 153 ngày nồng độ của acid amin và nitơ hòa tan là tương tự nhau trong tất cả các sản phẩm [48].
Chayovan và cộng sự cho rằng nhiệt độ tối ưu cho sản xuất nước mắm thương mại là 37 °C [22, 23]. Tuy nhiên, việc phơi nắng trong quá trình lên men của các nước ở Đông Nam Á mang lại kết quả thủy phân protein nhanh hơn.
Sử dụng acid:
Thêm acid ở nhiệt độ môi trường xung quanh sẽ kích thích hoạt động của enzyme thủy phân protein có tính acid, như pepsin được tìm thấy nhiều trong dạ dày cá.
Beddows và Ardeshir đã nghiên cứu việc sử dụng HCl trong sản xuất nước mắm. Họ báo cáo rằng điều kiện tối ưu là: pH = 2 và muối 10% (W/W) hoặc pH = 3 và muối 15% (W/W), sự thủy phân bằng axit xảy ra nhanh hơn so với phương pháp lên men truyền thống, nhưng sản phẩm cuối cùng có hương thơm rất ít [19].
Thủy phân kiềm:
Quá trình thủy phân protein cá được tăng cường nếu cá được điều chỉnh đến độ pH kiềm và sau đó trung hòa. Tuy nhiên, phương pháp này ảnh hưởng xấu đến chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm cuối cùng nên không được khuyến khích cho chế biến thực phẩm [25, 30].
Bổ sung enzyme:
Các protease thương mại từ thực vật như: Bioprase, Pronase, Papain, Bromelin và Ficin, tất cả đã được nghiên cứu để bổ sung vào cá nhằm đẩy nhanh quá trình lên men trong sản xuất nước mắm.
Murayama và cộng sự báo cáo rằng việc bổ sung Bioprase và Pronase giảm thời gian lên men xuống còn 70 ngày và chất lượng nước mắm tốt [42]. Năm 1972, Guevara và cộng sự sử dụng Papain trong sản xuất nước mắm Philippines (Patis) và báo cáo rằng thời gian lên men giảm xuống 4 -7 ngày mà không có bất kỳ ảnh hưởng có hại lên hương vị của nước mắm [28].
Beddows và cộng sự đã cho thấy, mức độ phân giải protein cao trong quá trình lên men cá thu ở 38 oC có chứa 0,2% Bromelin [21].
Beddows và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của việc thêm: Bromelin (0,8%), Papain (2,75%) và Ficin (2,5%) lên tốc độ thủy phân protein. Qua đó, họ thấy Bromelin cho các kết quả tốt hơn so với Papain hoặc Ficin. Với việc bổ sung Bromelin thì lượng protein cá được hòa tan trong 18 – 21 ngày ở 33 oC là cao hơn so với sử dụng Papain và Ficin. Sự phân bố nitơ là tương tự như phương pháp lên men truyền thống. Nhưng sản phẩm cuối cùng thiếu mùi thơm [19].
Ở Nhật Bản, Miyazawa và cộng sự đã nghiên cứu nước mắm sản xuất từ cá cơm, được lên men với muối 20 % và thêm “Koji” (35%) hoặc pronase (0,5%) ở 30 °C trong 150 ngày. Việc bổ sung “Koji” đã ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành của các acid amin tự do, trong khi ảnh hưởng của pronase thủy phân protein là không đáng kể [40].
Ooshiro và cộng sự đã nghiên cứu việc sử dụng papain, bromelin và trypsin trong sản xuất nước mắm từ cá mòi. Kết quả tối ưu là sử dụng papain 0,3% tại pH = 5,2 ở 37 °C với muối 25%. Màu sắc và vị cuối cùng của sản phẩm là tốt nhưng không có mùi thơm đặc trưng của nước mắm. Hơn nữa quá trình lên men kéo dài (340 – 350) ngày [48].
Raksakulthai và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme thủy phân protein (protease của nấm mốc, pronase, trypsin, chymotripsin protease của mực) hoặc gan tụy mực lên sản xuất nước mắm. Kết quả cho thấy khi lên men được thực hiện bằng cách sử dụng cá xay nhỏ trộn với muối tỷ lệ 4:1, nhiệt độ: 20 – 250C và gan, tụy mực (2,5%), thì cho nước mắm có chất lượng tốt. Việc bổ sung các chế phẩm enzyme khác nhau vào cá đã làm tăng nhanh tốc độ thủy phân protein với hàm lượng axit amin tự do cao hơn, nhưng không làm tăng sản lượng nước mắm [55].
Nước mắm được sản xuất từ việc bổ sung gan, tụy mực được chấp nhận và ưa thích hơn so với Patis thương mại. Tuy nhiên, việc bổ sung gan tụy mực đã không cải thiện được thời gian lên men.
Các nghiên cứu đã cho thấy protease nội tạng đã thúc đẩy sự hòa tan protein trong cá. Tuy nhiên, proteinase hoạt động giảm dần trong quá trình lên men nước mắm do hàm lượng muối cao (25% NaCl) [64]. Do đó, bổ sung các nội tạng như là một nguồn của proteinase có thể không phải là một biện pháp hiệu quả để thúc đẩy hòa tan protein.
Sử dụng vi khuẩn hoặc các enzyme của chúng.
Ok và cộng sự đã nghiên cứu khả năng đẩy nhanh quá trình lên men nước mắm bằng việc bổ sung các vi khuẩn ưa mặn. Khi thêm Bacillus C1 và C6 (phân lập từ nước mắm của Trung Quốc) vào hỗn hợp cá mòi và muối ở 30 °C thì thời gian lên men giảm xuống 3 tháng [47].
Nakano và cộng sự đã sử dụng protease từ vi khuẩn ưa mặn Psedomonas
để làm giảm thời gian lên men nước mắm. Kết quả chỉ ra rằng các enzyme có thể làm giảm thời gian lên men từ 1,5 – 3 năm đến 3 – 6 tháng và sản phẩm có chứa acid amin có giá trị dinh dưỡng với hàm lượng cao [43]. Kiểm tra cảm quan cho thấy rằng các nước mắm có chất lượng tốt so với sản phẩm thương mại.
4.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về sự thủy phân protein bằng enzyme proteaza enzyme proteaza
Liaset và cộng sự đã nghiên cứu thu hồi nitơ từ xương cá hồi Atlantic từ quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex. Xương cá hồi được xay nhỏ và thủy phân với điều kiện tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1,16 : 1, tỷ lệ enzyme/cơ chất là 90 AU/ Kg, pH là 6,5 và nhiệt độ nghiên cứu từ 35 °C đến 70 °C. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi thủy phân ở chế độ đó thì hiệu suất thu hồi nitơ tăng theo nhiệt độ, đạt cao nhất tại 50 °C với 53,5% khi nhiệt độ càng tăng cao hơn nửa thì hiệu