2.2.1 Phương pháp xác ựịnh thánh phần hóa học của nguyên liệu
− Xác ựịnh hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt ựộ 1050C theo TCVN 3700 Ờ 1990.
−Xác ựịnh hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3570 Ờ 1990. Hàm lượng Protein tổng số = 6,25 x hàm lượng Nitơ tổng số.
−Xác ựịnh hàm lượng ựạm Nitơ amoniac bằng phương pháp chưng kéo hơi nước.
−Xác ựịnh hàm lượng Nitơ Focmon bằng phương pháp Sorensen.
2.2.2 Phương pháp phân tắch vi sinh vật
định danh vi sinh vật ựược thực hiện tại Viện PASTEUR Nha Trang. Phương pháp phân tắch: ISO 16266 : 2006 (E).
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
2.3.1 Sơ ựồ nội dung nghiên cứu.
Những nội dung nghiên cứu chắnh của ựề tài ựược trình bày trên sơựồ 2.1
Sơ ựồ 2.1: Nội dung nghiên cứu chắnh 2.3.2 Bố trắ thắ nghiệm.
2.3.2.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh proteaza từ tôm.
Mục tiêu của thắ nghiệm là tuyển chọn ựược chủng vi sinh vật sinh tổng hợp protease mạnh nhất ựối với protein tôm từ nguyên liệu tôm ựểứng dụng vào nghiên cứu các bước sau.
Thắ nghiệm có thể chia làm 2 bước:
đánh giá khả năng sinh proteaza từ các chủng vi sinh vật ựã tuyển chọn ựược.
Ứng dụng dịch nuôi cấy chứa proteaza vào khử protein từ ựầu tôm. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp proteaza từ
− Bước 1: Tiến hành phân lập chủng vi sinh vật trên tôm nguyên liệu và giữ chủng. Bước 1 ựược bố trắ theo sơựồ 2.2
− Bước 2: Từ các chủng phân lập ựược lựa chọn chủng có vòng ly giải protein lớn. Bước 2 ựược bố trắ theo sơựồ 2.3
24 ọ 48h / 370C
24h / 370C
Sơ ựồ 2.2: Thắ nghiệm phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm
Theo sơ ựồ này các bước ựược thục hiện như sau: Cấy phân lập vi sinh vật trên tôm vào môi trường thạch dinh dưỡng chứa 1,5% protein tôm xay. Tiến hành nuôi cấy ở 370C trong vòng 24 ọ 48h. Chọn khuẩn lạc có vòng ly giải protein rồi cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa 0,5% casein. Cũng tiến hành nuôi
Tôm
Môi trường thạch dinh dưỡng 1,5% tôm xay
Chọn khuẩn lạc có vòng ly giải Protein
Cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa casein 0,5 %.
Chọn khuẩn lạc có vòng ly giải protein và ựem giữ chủng trên môi trường thạch dinh dưỡng.
cấy ở 370C trong vòng 24h. Lựa chọn khuẩn lạc có vòng ly giải protein và tiến hành giữ chủng trên ống thạch ựứng.
Sơ ựồ 2.3: Thắ nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh proteaza từ tôm nguyên liệu
Theo sơ ựồ này các bước ựược tiến hành như sau: Cấy ria các chủng giữ ựược trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa 0,5% casein. Nuôi cấy ở 370C trong vòng 48h. Chọn khuẩn lạc có ựường kắnh vòng ly giải lớn ựem thử nghiệm khả
năng sinh proteaza (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2.2. định danh vi sinh vật
Do thiếu môi trường thử nghiệm nên các chủng vi khuẩn tuyển chọn ựược xác ựịnh sơ bộ bằng phương pháp nhuộm Gram, rồi gửi mẫu nhờ Viện Pasteur Nha Trang ựịnh danh giúp. Có thể thể hiện thắ nghiệm ựịnh danh vi sinh vật bằng sơựồ
2.4
Từ các chủng phân lập ựược
Cấy ria
Môi trường thạch dinh dưỡng chứa casein 0,5%.
48h / 370C Chọn khuẩn lạc có vòng ly giải protein
Sơ ựồ 2.4: Thắ nghiệm ựịnh danh vi sinh vật
Vi sinh vật ựã phân lập ựược trên môi trường thạch dinh dưỡng.
Chọn khuẩn lạc rời, ựiển hình
Nhuộm Gram.
2.3.2.3 Bố trắ thắ nghiệm thu nhận dịch nuôi cấy chứa proteaza
Thắ nghiệm ựược bố trắ theo sơựồ 2.5
370C / 24h
Sơ ựồ 2.5:Thắ nghiệm thu nhận dịch nuôi cáy chứa enzym Proteaza 2.3.2.4. Bố trắ thắ nghiệm ựánh giá khả năng sinh Proteaza từ các chủng vi khuẩn phân lập ựược
Nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn ựược trên môi trường thạch dinh dưỡng.
Cấy vi khuẩn ựã nuôi cấy vào 100ml dịch tôm xay 1,5 %.
Ly tâm bỏ cặn lắng thêm kháng sinh ựể diệt khuẩn
đểựánh giá hoạt tắnh thủy phân protein của proteaza trong các dịch nuôi cấy tiến hành cho dịch enzym thủy phân protein rồi xác ựịnh ựạm acid amin so sánh với mẫu chứng ( mẫu B: dùng nhiệt ựộựể bất hoạt enzym).
Sau khi ựánh giá khả năng sinh proteaza từ các chủng phân lập ựược chọn chủng có khả năng sinh proteaza mạnh nhất ựể tiến hành bước tiếp theo.
Tiến hành ựối với từng chủng một theo sơựồ 2.6: Thủy phân ở nhiệt ựộ phòng Xác ựịnh ựạm acid amin
Sơ ựồ 2.6: Thắ nghiệm ựánh giá khả năng sinh Proteaza từ các chủng vi khuẩn phân lập ựược
Dịch nuôi cấy chứa enzym Proteaza
Lấy 40ml dịch enzym bổ sung vào 60ml dịch tôm xay (mẫu A)
Lấy 40ml dịch enzym ựun 1000C/10 phút bổ sung vào 60ml dịch tôm xay (mẫu B)
2.3.2.5. Bố trắ thắ nghiệm ứng dụng khả năng khử protein ựầu tôm của dịch nuôi cấy chứa proteaza
Dịch nuôi cấy chứa Proteaza có thể sử dụng trực tiếp ựể khử protein có trong
ựầu tôm Ờ trong sản xuất Chitin.
Thắ nghiệm này nhằm so sánh tìm ra ựiểm khác biệt giữa sử dụng Enzym và không sử dụng Enzym trong khử protein ựầu tôm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thắ nghiệm ựược bố trắ theo sơựồ 2.7:
Nước rửa 1 Vỏ tôm 1 Nước rửa 2 Vỏ tôm 2
Sơ ựồ 2.7:Thắ nghiệm ứng dụng khả năng khử protein ựầu tôm của dịch nuôi cấy chứa proteaza
100 gam ựầu tôm ép (1) 100 gam ựầu tôm ép (2)
Ngâm trong 100ml dịch Proteaza thu ựược + chất ức
khuẩn.
Ngâm trong 100ml nước thường.
Ngâm trong 18h. Rửa Xác ựịnh hàm lượng Protein tổng số. Ngâm trong 18h. Rửa Xác ựịnh hàm lượng Protein tổng số.
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp proteaza từ nguyên liệu tôm.
Từ môi trường canh thang thường và dịch tôm 1,5% và phân lập trên môi trường thạch dinh dưỡng chứa casein 0,5% phân lập ựược 10 chủng kắ hiệu lần lượt là P1ẦP10. Khuẩn lạc của chủng vi sinh vật phân lập ựược ựều có vòng trong xung quanh và có khả năng ly giải protein.
Từ 10 chủng phân lập ựược trên, ựể tuyển chọn chủng có khả năng sinh proteaza mạnh nhất, trước hết tiến hành tuyển chọn sơ bộ bằng cách ựo ựường kắnh ly giải protein (Dp) và ựường kắnh khuẩn lạc (d) và tắnh tỷ số Dp/d, chọn những khuẩn lạc có tỷ số Dp/d lớn ựể tiếp tục nghiên cứu. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả thể hiện dưới bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả thắ nghiệm tuyển chọn sơ bộ chủng vi sinh vật sinh tổng hợp proteaza
Trong ựó:
− Dp : ựường kắnh ly giải protein.
− d : ựường kắnh khuẩn lạc
Ký hiệu chủng vi sinh vật Khả năng ly giải protein (Kp = Dp/d) P1 1,98 ổ 0,02 P2 1,85 ổ 0,01 P3 1,71 ổ 0,02 P4 1,25 ổ 0,01 P5 1,54 ổ 0,02 P6 1,37 ổ 0,01 P7 1,42 ổ 0,01 P8 1,69 ổ 0,01 P9 1,11 ổ 0,01 P10 1,06 ổ 0,02 Từ kết quảở bảng 3.1 cho thấy, cả 10 chủng ựều có khả năng ly giải protein. Tuy nhiên, mỗi chủng khả năng mạnh yếu khác nhau. Nếu xét về khả năng ly giải protein thì các chủng P1, P2, P3 mạnh hơn 7 chủng còn lại. Như vậy với mục tiêu tuyển chọn ựược chủng có khả năng sinh tổng hợp proteaza mạnh, thì ởựây sơ bộ
chọn ựược 3 chủng P1, P2 và P3 (từ 10 chủng phân lập ựược) ựể nghiên cứu tiếp. Sau khi tiến hành phân lập có thểựưa ra một số kết luận về chủng vi sinh vật phân lâp ựược như sau:
được phân lập từ nguyên liệu tôm. Có vòng ly giải protein.
Tiến hành xác ựịnh ựặc ựiểm vi sinh vật phân lập ựược bằng phương pháp nhuộm tế bào và soi kắnh hiển vi.
3.2 Xác ựịnh hoạt ựộ proteaza của chủng vi sinh vật sinh proteaza phân lập ựược.
Việc xác ựịnh hoạt ựộ enzym proteaza của chủng vi sinh vật phân lập ựược có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc ựánh giá chất lượng của chủng vi sinh vật phân lập ựược cũng như mức ựộ thành công của ựề tài.
Thắ nghiệm bố trắ nhằm so sánh hàm lượng ựạm acid amin tạo ra giữa 2 mẫu A ( có bổ sung 40ml chế phẩm enzym proteaza thu ựược vào 60ml dịch tôm và tiến hành thủy phân ở nhiệt ựộ thường) và mẫu B (cũng bổ sung 40ml chế phẩm enzym proteaza ựun ở 1000C trong vòng 10 phút nhằm bất hoạt enzym bổ sung vào 60ml dịch tôm và tiến hành thủy phân ở nhiệt ựộ phòng).
Tiến hành xác ựịnh 3 lần ở 3 thời gian khác nhau dựa vào hàm lượng ựạm acid amin tạo thành. Hàm lượng ựạm acid amin ựựoc xác ựịnh dựa vào hàm lượng
ựạm amoniac (NNH3) và ựạm Focmon (NF).Hàm lượng ựạm NNH3 của 3 chủng P1, P2, P3ựược thể hiện lần lượt ở bảng 3.2, 3.3 và 3.4 và ựược trình bày lần lượt trong các bảng 4.1, 4.2, 4.3 phần phụ lục. Hàm lượng ựạm NF của 3 chủng P1, P2, P3ựược thể
hiện lần lượt ở bảng 3.5, 3.6 và 3.7 và ựược trình bày lần lượt trong bảng 4.3, 4.4, 4.5 ở phần phụ lục. Hàm lượng ựạm acidamin Naa của 3 chủng P1, P2, P3 ựược thể
hiện lần lượt ở các bảng 3.8, 3.9 và 3.10 và ựược trình bày trong bảng 4.6, 4.7, 4.8 phần phụ lục.
Bảng 3.2: Kết quả hàm lượng ựạm NNH3 của chủng P1 trong 3 lần xác ựịnh
Hàm lượng ựạm NNH3 (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B 24 4,07 3,7 37 4,48 4,17 P1 48 6,01 4,63
Bảng 3.3: Kết quả hàm lượng ựạm NNH3 của chủng P2 trong 3 lần xác ựịnh Hàm lượng ựạm NNH3 (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B 24 3,92 3,7 37 4,36 4,17 P2 48 5,84 4,63 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4: Kết quả hàm lượng ựạm NNH3 của chủng P3 trong 3 lần xác ựịnh
Hàm lượng ựạm NNH3 (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B 24 3,81 3,7 37 4,21 4,17 P3 48 5,55 4,63
Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng ựạm NF của chủng P1 qua 3 lần xác ựịnh
Hàm lượng ựạm NF (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B 24 10,2 6,4 37 13,79 7,68 P1 48 18,35 8,65
Bảng 3.6: Kết quả hàm lượng ựạm NF của chủng P2 qua 3 lần xác ựịnh Hàm lượng ựạm NF (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B 24 9,67 6,4 37 11,04 7,68 P2 48 15,92 8,65
Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng ựạm NF của chủng P3 qua 3 lần xác ựịnh
Hàm lượng ựạm NF (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B 24 8,43 6,4 37 10,25 7,68 P3 48 14,08 8,65
Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng ựạm Naa của chủng P1 qua 3 lần xác ựịnh
Hàm lượng ựạm Naa (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B Naa(A) Ờ Naa(B) (gN/l) 24 6,13 2,7 3,43 37 9,31 3,51 5,80 P1 48 11,74 4,02 7,72
Bảng 3.9: Kết quả hàm lượng ựạm Naa của chủng P2 qua 3 lần xác ựịnh Hàm lượng ựạm Naa (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B Naa(A) Ờ Naa(B) (gN/l) 24 5,75 2,7 3,05 37 6,68 3,51 3,17 P2 48 10,08 4,02 6,06
Bảng 3.10: Kết quả hàm lượng ựạm Naa của chủng P3 qua 3 lần xác ựịnh
Hàm lượng ựạm Naa (gN/l) Tên chủng Thời gian thủy phân (h) Mẫu A Mẫu B Naa(A) Ờ Naa(B) (gN/l) 24 4,62 2,7 1,92 37 6,04 3,51 2,53 P3 48 8,53 4,02 4,51 Thảo luận : Từ các bảng 3.2...3.10 ta thấy hàm lượng ựạm NH3, ựạm focmon, ựạm acid amin ựều tăng theo thời gian. điều này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Luyến [15]. Hàm lượng NNH3 tăng dần là do có quá trình phân hủy các chất như peptid, acid amin dưới tác ựộng của vi sinh vật. Ngoài ra trong nguyên liệu còn tồn tại một lượng amoniac nhất ựịnh.
So sánh hàm lượng ựạm acid amin ở 2 mẫu A và mẫu B nhận thấy ở cùng một thời gian hàm lượng ựạm acid amin của mẫu A luôn cao hơn mẫu B. điều này cho thấy dịch enzym thu ựược ựã phân hủy protein ựể tạo thành acid amin làm cho hàm lượng ựạm acid amin ở mẫu A tăng lên rõ rệt so với mẫu B. Như vậy có thể
thấy rằng dịch nuôi cấy chứa proteaza thu nhận từ các chủng vi sinh vật phân lập
ựược từ tôm nguyên liệu có khả năng thủy phân rất tốt.
Qua 3 bảng 3.8, 3.9, 3.10 ta thấy hàm lượng ựạm acid amin do chủng P1 thủy phân protein tạo ra cao hơn hẳn so với 2 chủng còn lại P2 và P3. điều này chứng tỏ
chủng P1 có kết quả thủy phân tốt nhất trong 3 chủng chọn ựược. để làm rõ hơn khả
năng thủy phân của chủng P1 tốt hơn 2 chủng P2 và P3 ta có thể dựa vào kết quả xác
ựịnh hoạt ựộ enzym của dịch nuôi cấy chứa enzym Proteaza (HựP) của cả 3 chủng. Ta tiến hành xác ựịnh hoạt ựộ phân giải protein của dịch nuôi cấy chứa Proteaza của chủng P1 bằng phương pháp chuẩn ựộ Focmon. [16] (Phụ lục 3). Kết quảựược trình bày dưới bảng 3.11
Hoạt ựộ proteaza (HựP) Chủng vi khuẩn 24h 37h 48h P1 3,1 4,97 4,6 P2 2,5 3,3 3,5 P3 2,3 2,7 2,1
Từ bảng 3.11 ta càng khẳng ựịnh ựược khả năng phân giải protein của chủng P1 là tốt nhất trong 3 chủng phân lập ựược. Vì vậy nên chọn chủng P1 ựể tiến hành bước nghiên cứu tiếp theo của ựề tài.
3.3. Ứng dụng dịch nuôi cấy chứa proteaza vào khử protein ựầu tôm
− Từ kết quảở phần 3.2 chọn chủng P1ựem thắ nghiệm.
− Tiến hành khử protein ựầu tôm a. Ép tách protein ựầu tôm
Bảng 3.12: So sánh thành phần hóa học ựầu tôm trước và sau khi ép tách
STT Thành phần hóa học (%) Trước khi ép tách Sau khi ép tách 1 độẩm 76,2 32,57 2 Hàm lượng khoáng 17,83 4,86 3 Hàm lượng protein 49,37 42,98
Qua bảng 3.11 ta thấy công ựoạn ép giúp loại bớt một lượng ựáng kể hàm lượng khoáng và protein trong ựầu tôm: hàm lượng khoáng sau khi ép tách chỉ còn chiếm 4,86g/100g ựầu tôm tươi. Như vậy hàm lượng khoáng giảm 3,67 lần sau khi ép. Hàm lượng protein sau khi ép tách chỉ còn chiếm 42,98g/100g ựầu tôm tươi. Như vậy hàm lượng protein của ựầu tôm ựã giảm 1,15 lần. đây chắnh là kết quả
quan trọng ựể bước ựầu nghiên cứu giảm lượng dịch nuôi cấy chứa proteaza thu nhận từ chủng P1 vào khử protein ựầu tôm.
Sử dụng dịch nuôi cấy chủng P1 chứa proteaza ựể khử ựầu tôm ép tách nước và protein. Kết quảựược trình bày trên bảng 3.13
Bảng 3.13: Hàm lượng protein tổng số trong nước rửa và còn lại trong vỏ tôm Hàm lượng protein tổng số Mẫu 1 (có enzym Proteaza) Mẫu 2 (không có enzym Proteaza) Vỏ tôm (%) 14,85 36,1 Nước rửa (gN/l) 28,13 6,88 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ bảng 3.13 ta thấy khi sử dụng dịch chứa enzym Proteaza vào khử protein của ựầu tôm thì hàm lượng protein tổng số còn lại trong vỏ ựầu tôm còn 14,85%. Còn nếu chỉ ép và rửa bằng nước thường thì hàm lượng protein tổng số còn lại trong vỏ tôm lên ựến 36,1 %.
Ta có thể tắnh ựược % protein tách ựược so với ban ựầu ( Kyung Ờ TaekOh và cộng sự, 2007) bằng công thức:
DP (%) =
P0.O Ờ PR.R
P0.O
Trong ựó:
P0, PR: hàm lượng protein (g/g) trước và sau quá trình tách Protein. O, R: khối lượng mẫu trước và sau quá trình tách Protein.
DP: % protein tách ựược so với ban ựầu. Theo công thức trên:
Mẫu 1 có DP (%) = 81,05 % Mẫu 2 có DP (%) = 53,93%.
Như vậy hiệu suất tách protein của mẫu 1 (có enzym ) cao hơn mẫu 2 ựến