Thành phần Thể tích 30% acrylamide/0.8% bisacrylamide 0.65 ml 4X Tris-Cl/SDS, pH=6.8 1.25 ml Nước 3.05 ml 10% amoni persulfat 25 µl TEMED 5 µl
Bước 3: Sau khi lớp gel đã đông hoàn toàn, rút bỏ lớp nước phía trên ra và đổ tiếp lớp stacking gel nên trên cho tới đầy buồng gel. Sau đó đặt lược vào buồng gel nên trên cho tới đầy buồng gel. Sau đó đặt lược vào buồng gel tránh tạo bọt khí dưới các răng lược, để tạo các giếng thạch. Quá trình polyme hóa lớp gel này khoảng 30 phút.
Bước 4: Chạy điện di
+ Sau khi lớp gel thứ 2 đông lại gỡ lược ra khỏi gel và khuôn kính ra khỏi khung cố định. Đặt khuôn kính đó vào trong thiết bị chạy điện di.
+ Chuẩn bị dung dịch chạy điện di:
Đầu tiên chuẩn bị dung dịch 5X SDS/electrophoresis buffer: Thành phần Khối lượng
Tris Base 15.1 g
Glycine 72.0 g
SDS 5.0 g
Sau khi pha xong dung dịch 5X SDS/ electrophoresis buffer thì ta thêm nước vào tạo thành dung dịch 1X SDS/ electrophoresis buffer.
+ Cho toàn bộ bản gel được đặt trong buồng điện di có chứa đầy dung dịch điện di 1X.
+ Mẫu protein: Lấy 10µl protein + 5µl PBL + 5µl SDS 10% cho vào ống eppendorf, sau đó đặt mẫu vào nước nóng 1000C trong 5–10 phút để làm biến tính protein. Sau đó lấy mẫu cho lần lượt vào các giếng.
+ Điện di ở 110V đến khi mẫu chạy qua gần hết bản gel cách đáy 1cm. Bước 5: Nhuộm bản gel
Sau khi chạy điện di xong, bản gel được nhuộm bằng dung dịch 0.1% Coomassie Blue R–250 (Methanol: glacial acetic acid: nước = 4:1:5) được lọc qua giấy whatman ở 500C trong thời gian 30 phút.
Bước 6: Tẩy màu
Cho bản gel vào trong dung dịch (Methanol : glacial acetic acid : nước = 1:1:8)
Lắc nhẹ trong 30 phút. Thay dung dịch tẩy màu khoảng 2–3 lần cho đến khi bản gel mất màu và nhìn thấy các vạch xuất hiện. Sau đó đổ dung dịch này đi.
Bước 7: Sau khi tẩy màu xong bản gel được chuyển vào một tờ giấy lọc whatman và sấy khô ở 800C trong 80 phút.
CHƯƠNG III