2.1 Vật liệu nghiên cứu2.1.1 Hóa chất 2.1.1 Hóa chất
- Enzyme giới hạn, enzyme RANase.
- Cao nấm men, trypton, NaCl, agar dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
- Đĩa peptri nuôi vi khuẩn.
- Ống fancol 15ml, 50ml, ống eppendorf. - Bình tam giác 250ml để nuôi cấy vi sinh vật. - Pipette, đầu côn, nút bông, tăm.
- Kháng sinh ampicillin. - TE buffer để tách ly tâm.
- Cồn 960 và cồn 700 sử dụng trong khử trùng và vệ sinh.
2.1.2 Thiết bị
- Nồi hấp: vô trùng môi trường, dụng cụ... - Tủ cấy UV dùng trong nuôi cấy vi sinh vật. - Tủ lắc để nuôi cấy môi trường lỏng.
- Tủ lạnh, tủ đông dùng trong bảo quản môi trường, vi sinh vật. - Máy lắc vortex: dùng lắc, trộn, hoà tan dung dịch.
- Máy ly tâm: ly tâm thu tế bào. - Máy chạy điện di:
+ Máy chạy điện di DNA + Máy chạy điện di protein.
- Lò vi sóng, bếp từ… dùng trong chạy điện di. - Bình ổn nhiệt
- Cân điện tử.
2.1.3 Chủng vi sinh vật
- Chủng Chủng vi khuẩn E.coli XL1–Blue MRF (Stratagene, Mỹ) được sử dụng là vật chủ chuẩn bị plasmid tái tổ hợp và thao tác ADN.
- Chủng vi sinh vật E.coli BL21 DE3 (Hàn Quốc) là vật chủ biểu hiện plasmid chứa gen NovU.
2.1.4 Vector và Plasmid tái tổ hợp
Tên Đặc điểm Nguồn tham khảo
pET-32a(+) Vector biểu hiện trong E.coli
T7 promoto; Ampr
Công ty Novogen, Hàn Quốc
NovU NovU được chuyển vào pET-32a(+)
Khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học
Mở Hà Nội.
Bảng 1. Cosmids/ plasmid và tái tổ hợp plasmid trong nghiên cứu
2.2 Điều kiện nghiên cứu2.2.1 Điều kiện nuôi cấy 2.2.1 Điều kiện nuôi cấy
Cấy trên đĩa petri: Nuôi trong tủ cấy ở 370C, trên môi trường LB đặc, trong 16 giờ.
Cấy tăng sinh cấp 1: Lấy 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung 3µl Ampicillin cho vào trong ống fancol 15ml, rồi đem nuôi trong máy lắc 200 vòng/phút, ở 370C, 14–16giờ. Mục đích của quá trình cấy đĩa peptri và cấy tăng sinh lần 1 đó là nuôi cấy tế bào và tạo ra một số lượng lớn tế bào.
Cấy tăng sinh cấp 2: Lấy 30ml môi trường LB lỏng bổ sung 30µl Ampicillin cho vào bình tam giác (250ml) đã được khử trùng. Cho tiếp 300µl giống tăng sinh cấp 1 vào rồi đem nuôi ở máy lắc 200 vòng/phút.
Riêng đối với quá trình cấy tăng sinh cấp 2 này thì ta tiến hành ở các nồng độ IPTG, nhiệt độ và thời gian khác nhau.
Mục đích của việc làm này là tìm điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tạo protein tan nội bào (enzyme nội bào) bao gồm: Nồng độ IPTG (chất có khả năng điều hòa dương tính), nhiệt độ và thời gian.
2.2.2 Môi trường nuôi cấy
2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy đĩa thạch Luria–Bertani (LB) đặc:
Môi trường LB đặc là môi trường nuôi cấy vi sinh vật để chúng phát triển bình thường.
Thành phần tạo một môi trường LB đặc
Thành phần Thể tích
Tripton 10 g/l
Aga 20 g/l
Tổng 45 g/l
2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy tăng sinh Luria–Bertani (LB) lỏng
Môi trường LB lỏng là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật tăng nhanh về số lượng tế bào.
Thành phần tạo một môi trường LB lỏng
Thành phần Thể tích Tripton 10 g/l Cao nấm men 5 g/l NaCl 10 g/l Tổng 25 g/l 2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch 2.2.2.1 Buffer
Buffer được pha chế từ NaH2PO4 có tính acid nhẹ và Na2HPO4 có tính kiềm nhẹ. Dựa vào máy đo pH để điều chỉnh pH nhờ hai loại hóa chất trên. Buffer thích hợp cho môi trường ly tâm là buffer có pH= 7–7.2.
2.2.2.2 Dung dịch điện di