2.2.1 Phương pháp xác định số lượng các nhóm VSV trong nước thải và trong bùn hoạt tính
2.2.1.1 Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí phân giải tinh bột tổng số
Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy VSV, sau đó môi trường được đun tới khi tan hết tinh bột và thạch. Tiếp theo, môi trường được chuyển vào các bình tam giác,
45
được khử trùng ở điều kiện 0,8 atm ở 1210C trong 30 phút. Sau khi khử trùng, để thạch nguội đến khoảng 500C, tiến hành đổ ra đĩa petri. Lượng thạch đổ vào mỗi đĩa khoảng 15 – 20 ml, sau đó sấy khô mặt thạch trong tủ sấy trong 30 phút.
Lấy 1 ml mẫu nước thải sản xuất bún cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước cất vô trùng, được nồng độ pha loãng 10-1. Tiến hành lắc đều ống nghiệm, sau đó lấy 1 ml dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng, được nồng độ pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục như vậy tiến hành pha loãng đến độ pha loãng cần thiết. Sau đó, dùng pipet man lấy 50µl dung dịch mẫu nước thải đã pha loãng ở nồng độ cần thiết nhỏ vào chính giữa đĩa thạch đã chuẩn bị như đã nêu ở trên. Sau đó, các đĩa thạch được đậy lại và bao gói kín bằng giấy, đặt trong tủấm ở 28 - 300C. Sau 2 – 5 ngày lấy đĩa ra quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc đã mọc.
Công thức tính số lượng VSV (CFU/ml dung dịch) như sau:
X = A x 20 x 10n
A: Số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch; 10n: Nghịch đảo nồng độ pha loãng; X: Số lượng VSV (CFU/ml dung dịch); CFU: là đơn vị hình thành khuẩn lạc.
2.2.1.2 Phương pháp xác định vi sinh vật kỵ khí phân giải tinh bột tổng số
- Xác định số lượng VSV kỵ khí theo phương pháp MPN (The Most Probable Number Method). Phương pháp MPN còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng VSV theo số lượng VSV có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
46
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của VSV cần kiểm định trong từng ống nghiệm, ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady (bảng 4) suy ra mật độ VSV được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.
Quy trình thực hiện việc xác định số lượng VSV kỵ khí như sau:
- Pha loãng mẫu nước thải: Dùng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) để pha loãng. Cách pha loãng như sau: Lấy 0,5 ml mẫu nước thải và bổ sung thêm 4,5 ml nước muối sinh lý trên sẽđược dung dịch nước thải có nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó lại lấy 0,5 ml dung dịch này bổ sung thêm 4,5 ml nước muối sinh lý, khi đó được dung dịch nước thải có nồng độ 10-2. Cứ tiếp tục như vậy, thu được nước thải với nồng độ pha loãng từ 10-3đến 10-9.
- Cách cấy mẫu: Hút 1 ml dung dịch nước thải được pha loãng ở các nồng độ 10-1 đến 10-9, bổ sung vào môi trường thạch đã được đổ đầy ống nghiệm. Chú ý tránh tạo bọt khí, ống nghiệm được đậy chặt bằng nút cao su và dùng băng dính bọc ngoài nút. Sau đó, các ống nghiệm được để ở tủ ấm 370C trong khoảng từ 7 – 10 ngày. Sau 3 ngày nuôi, có thể lấy mẫu ra quan sát khả năng mọc của các VSV kỵ khí. Khi đó vi khuẩn yếm khí mọc thành các khuẩn lạc nhỏ, màu trắng nằm rải rác trong thạch, ngoài ra, có khả năng một số mẫu có mặt các vi khuẩn sinh metan làm cho thạch bị nứt, đứt đoạn nhiều nơi. Tra bảng 4 để xác định số lượng VSV kỵ khí.
Bảng 4. Bảng tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
Số lượng ống dương tính Số MPN/ 100 ml Số lượng ống dương tính Số MPN/ 100 ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 - 2 0 0 9 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15
47 0 1 1 6 2 1 1 20 0 1 2 9 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6 2 2 0 21 0 2 1 9 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 4 3 0 0 23 1 0 1 7 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 -
[Nguồn: Trần Linh Thước, 2002]