4. Một số quy trình sản xuất protein đơn bào từ nhóm vi sinh vật quang hợp
4.2.Ứng dụng trong sản xuất SCP
Chính vì những đặc điểm và vai trò của các vi sinh vật quang hợp kể trên mà chúng đƣợc áp dụng với các quy mô lớn trong việc sản xuất nguồn protein hay thế. Mặc dù đây là những sinh vật quang tự dƣỡng có thể phát triển một cách tự nhiên, nhƣng để đem lại hiệu suất lớn, cần có những đầu tƣ trong công nghiệp với các quy trình tiên tiến nhằm nâng cao hơn nữa năng suất, mà thực chất là thu đƣợc càng nhiều sinh khối của chúng đồng nghĩa với việc tạo điều kiện tối ƣu cho chúng phát triển.
Ở một số quốc gia, tảo đƣợc nuôi cấy trên quy mô lớn trong các ao nƣớc thải giàu oxy trong điều kiện ánh sang mặt trời hay hệ thống chiếu sáng nhân tạo để mở rộng không gian sản xuất.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất sinh khối. - Thời gian chiếu sáng
- Cƣờng độ ánh sáng - Nguồn cung cấp CO2 - Nguồn nito
- Các tế bào đang phát triển để duy trì các tế bào trong trạng thái lơ lửng
Sự nuôi lấy sinh khối tảo bắt đầu từ nhiều nƣớc nhƣ Nhật Bản, Đức, Mexico, Ấn Độ… Ở Ấn Độ, viện nghiên cứu công nghệ môi trƣờng quốc gia (NEERI) Nagpur đã phát triển kĩ nghệ nuôi cấy tảo trong hệ thống ao thải giàu oxy (Hình 3)
35
Hình 3 :Sơ đồ dòng nuôi cấy tảo trong các bể nước thải có sự oxy hóa và khả năng ứng dụng của sinh khối tảo
Việc thu hoạch sinh khối tảo có nhiều vấn đề bởi vì sự lắng xuống của các tế bào ở đấy và việc pha trộn môi trƣờng nuôi cấy. Các tế bào đƣợc thu hồi bằng cách ly tâm (phân tách), loại nƣớc và làm khô. Đôi khi 1 số chất kết tủa nhƣ nhôm sunfat, canxi hydroxide và các polymer có tính cation đƣợc thêm vào môi trƣờng nhƣng chúng không stheer tách ra khỏi các tế bào thu đƣợc. Vì thế phƣơng pháp này đảm bảo việc ứng dụng các sản phẩm SCP trong thực phẩm và chăn nuôi. Các phƣơng pháp phân tách và ly tâm cũng cho phép ly tâm, kết tủa và ly tâm cộng với sự kết tủa và ly tâm đi kèm với kết tủa nhƣng không khả thi về mặt kinh tế.
4.2.1. Sản xuất SCP từ vi khuẩn quang hợp thuộc chi Spirulina.
Việc thu hoạch các Cyanobacteria, nhóm vi khuẩn quang hợp, ví dụ nhƣ Spirulina
sp. ít khó khăn hơn vì chúng sống trôi nổi trên bề mặt nƣớc vi tế bào chúng chứa các không bào chứa đầy khí, kết quả tạo nên các thảm tảo nổi. Chúng có khả năng nữa là cố định đƣợc nguồn nito từ khí quyển. Trong quá trình xử lí chúng sẽ đƣợc làm khô với khí nóng tạo ra dạng bột mịn.
Những lợi ích từ SCP Spirulina:
Việc nuôi tạo sinh khối Spirulina đam lại nhiều lợi thế hơn so với Chloralla và Scenedemus bởi những lí do sau:
36
- Là dạng sợi nên Spirulina có thể đƣợc thu hoạch bằng các phƣơng pháp đơn giản và ít tốn kém hơn nhƣ dung màng lọc nylon hay cotton
- Các sợi Spirulina nổi lên trên mặt nƣớc do có các không bào khí, vì thế vấn đề thu hoạch đơn giản hơn.
- Có rất ít khả năng bị nhiễm trong pha sinh trƣởng của Spirula khi mà nó sinh trƣởng trên môi trƣờng pH kiềm, pH 8-11
- Chỉ cần làm khô trong nhiệt là có hiệu quả vì vách tế bào mỏng, trong khí đó làm khô bằng cách phun sấy là yêu cầu bắt buộc với Chlorella và Scenedesmus, rất tốn kém.
- Không gây tác dụng phụ cho con ngƣời cũng nhƣ động vật khi sử dụng.
- Spirulina có tính tiêu hủy cao do thành mỏng và hàm lƣợng acid acetic thấp (4%). Nó chƣa tỷ lệ protein dễ tiêu hóa cao (62-72%), vitamin, các aminoacid và các chất dinh dƣỡng khác (bảng 16)
Bảng 16: Thành phần các chất dinh dưỡng có trong Spirulina sp.
4.2.1.1. Sự nuôi cấy và sản xuất của Spirulina. a. Sản xuất tự nhiên
Hầu hết các hệ thống sản xuất thƣơng mại đều dựa trên các hệ thống kênh nông nơi mà môi trƣờng nuôi đƣợc mix đều bởi các bánh chèo. Tuy nhiên, vẫn còn một vài trƣờng hợp thu sinh khối với mục đích kinh tế từ các khu tự nhiên. Ví dụ nhƣ ở Mexico những năm 1967 vẫn còn thu vớt sinh khối của Spirulina maxima từ khu vực hồ Texcoco, ở độ cao 2200m so với mặt nƣớc biển, trong môi trƣờng cận nhiệt nơi mà nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 18oC. Đây có thể coi là nhà máy cho sinh khối tảo lớn nhất, dạng môi trƣờng nuôi cấy bán tự nhiên bao gồm việc thu sinh khối xuyên suốt ngày đêm và sinh khối tảo tăng gấp đôi chỉ trong 3 đến 4 ngày. Lƣợng thu đƣợc sẽ đƣợc đem lọc, phơi khô, làm đồng nhất và khử trùng.
37
Mặc dù các hồ này là điều kiện lí tƣởng cho sự phát triển của tảo, nhƣng vẫn có những yếu tố tự nhiên không kiểm soát đƣợc dẫ tới hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp. Tuy vậy, vẫn phải khẳng định rằng SCP ở những hồ này hoàn toàn tốt cho dinh dƣỡng của cá hay 1 số động vật.
b. Nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm.
Có tám yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến chất lƣợng của Spirulina: cƣờng độ ánh sáng, nhiệt độ (30oC). kích cỡ ủ, tốc độ khuấy, các chất rắn hòa tan (10-60g/lít) , pH 8.5-10.5 . chất lƣợng nƣớc, các chất đa lƣợng, vi lƣợng (C, N, P, K, S, Mg, Na, Cl, Ca and Fe, Zn, Cu, Ni, Co, Se)
Sau đây là một số môi trƣờng tối ƣu cho sự phát triển của chủng nhằm sinh khối lớn nhất.
Sử dụng nƣớc thải nhà máy rƣợu đƣợc phân giải kị khí (ADE) để sản xuất
Spirulina platensis (ARM 730) ( Rajeev Kaushik, 2006) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành:
Chuẩn bị chủng S.platensis (AMR 730) đƣợc giữ giống và nuôi trƣớc trong môi trƣờng Zarrouk.
Chuẩn bị các môi trƣờng pha loãng sử dụng ADE và các điều kiện nuôi cấy. Thành phần thu hồi của môi trƣờng ADE và Zarrouk đƣợc chỉ ra trong Bảng 17. Môi trƣờng ADE đƣợc sử dụng với các độ pha loãng khác nhau: 5, 10, 20, 30, 50 và 70%). Môi trƣờng ADE là môi trƣờng có đủ hàm lƣợng N, P, K và 1 số chất dinh dƣỡng khác. Ở đây, môi trƣờng Zarrouk đƣợc sử dụng nhƣ là môi trƣờng đối chứng.
38
Bảng 17: Thành phần hóa học của môi trường ADE và Zarrouk
Pha loãng 3 lần mỗi loại ADE và chỉnh pH đến 9 với NaOH 1N và đựng trong các bình lắc, môi bình lắc này đƣợc ủ với chủng đƣợc lấy từ môi trƣờng ban đầu với OD từ 0.8- 1 ở 560nm và 0.23µg chlorophyll/ml và ủ trong 2 tuần ở nhiệt độ khoảng 30oC , mật độ ánh sáng 2500 lux đƣợc lấy từ các tube huỳnh quang trắng lạnh, chu trình 12/12 giờ sáng tối. Môi trƣờng đƣợc lắc 2 lần 1 ngày cho đến khi thu hồi sinh khối.
Phƣơng pháp phân tích: Dịch nuôi cấy đƣợc dồng nhất bằng máy làm đồng nhất trƣớc kho mẫu đƣợc đánh giá các thông số khác nhau. Định lƣợng khối lƣợng khô đƣợc thực hiện bởi việc lọc 25ml mẫu chủng đã đồng nhất qua màng lọc Whatman (đƣờng kính 4cm). Màng lọc đƣợc làm khô trong không khí và chuyển sang nhiệt độ 80oC trong 4-6 giờ. Màng lọc khô cùng với sính khối sinh vật đƣợc làm lạnh trong máy dessicator và cân.
Chlorophyll tổng số đƣợc định lƣợng màu sắc bằng 10ml dịch đồng nhất với 95% methanol.
Định lƣợng protein, 0.5ml NaOH 1N đƣợc cho vào dịch mẫu, đun cách thủy 5 phút và protein đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp Lowry
39
Hàm lƣợng lipid đƣợc định lƣợng với các thiết bị Soxhlet, sử dụng hồn hợp chloroform và phenol (2:1) và đƣợc định lƣợng ở 628nm bằng phản ứng với sulfophosphovanilin.
Tổng lƣợng C đƣợc định lƣợng bằng thang chuẩn glucose.
BOD,TOC, và tổng lƣợng nito trong môi trƣờng ADE đầu tiên và dƣ thừa sau khi nuôi cấy Spirulina đƣợc định lƣợng qua sử dụng SPSS cho Window version 10.0.1.
Kết quả:
Các thông số thu đƣợc trong bảng III.2.3 Sinh khối thu đƣợc ở ADE 50% cao hơn so với môi trƣờng đối chứng, nồng độc ao hơn của ADE có lẽ không thích hợp cho sự phát triển của chủng, vì thế mà thu đƣợc ít sinh khối.
Bảng 18: Các thông số sinh trưởng và thành phần hóa học sau khi nuôi cấy 14 ngày chủng S.platensis trong môi trường có nồng độ ADE khác nhau và môi trường đối
chứng.
Hàm lƣợng TOC và sinh khối tăng dần trong các dịch pha loãng khác nhau (5- 50%).
Giới hạn về lƣợng Nito trong môi trƣờng ADE phản ánh sự thấp của nồng độ protein. Ngoại trừ nồng độ 50% ADE, các nồng độ khác đều có hàm lƣợng protein thấp hơn mẫu đối chứng.
Hàm lƣợng C tổng số trong mẫu 5,10, 20 % đƣơc chỉ ra ở mức trung bình nhƣ môi trƣờng đối chứng, nồng độ 75% chỉ ra ít nhất và cao nhất vẫn thuộc loại 50%.
40
Tỉ lệ C/P khi nuôi S. platensis cao hơn so với môi trƣờng Zarrouk và khi nồng độ ADE giảm, tỷ lệ C/P cũng giảm (Hình 4)
Không có sự khác biệt về lƣợng chlorophyll thu đƣợc.
Vì ánh sáng không đổi nên hàm lƣợng lipid tạo ra phụ thuộc nồng độ ADE. So với mấu đối chứng, ngoại trừ nồng độ ADE 50%, các nồng độ khác đều thu hồi lƣợng lipid thấp hơn. (Bảng 18)
Sự giảm BOD, TOC và tổng lƣợng N đƣợc nhận thấy trong môi trƣờng còn lại sau nuôi cấy chủng. (Hình 5) Ở đây, ngƣời ta lập mối quan hệ giữa khối lƣợng sinh khối và sự giảm các chỉ số dựa trên việc nuôi cây trên những nồng độ ADE khác nhau thu đƣợc. Đặc biệt chú ý ở nồng độ ADE 50% ứng với 1.23 mg/ml, hàm lƣợng N trong nƣớc có sự giảm đáng kể, điều này có ý nghĩa trong việc xử lí nƣớc thải bị ô nhiễm N.
Hình 4:Sự biến động tỷ lệ C/P cho thấy ảnh hưởng của nồng độ ADE
Hình 5: Sự giảm phần trăm N, C và BOD trong môi trường ADE nuôi cấy S. plantensis
41
Sản xuất sinh khối và các hợp chất thực phẩm chức năng bởi Spitulina platensis
dƣới điều kiện nhiệt độ và nito khác nhau ( Luciane Maria 2005) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trƣờng Zarouk nhƣ trên, trong đó thay đổi về nồng độ Nito khác nhau: 0.0625, 1.250, 1.875 và 2500g/l.
Chuẩn bị chủng S. platensis LEB 52 và nuôi cấy trong môi trƣờng trên ở 2 mức nhiệt độ khác nhau: 30 và 35 độ C.
Chủng S. platensis LEB 52 đƣợc nuôi cấy trong bể lên men ánh sáng 20l với lƣợng ban đầu là 14l và sinh khối là 0.15g/l. 2 tube kính đƣợc đƣua qua điểm dừng của bể, một trong 2 mẫu đƣợc thu hồi và 1 mẫu khác tiếp tục đƣợc sục khí CO2 vào. Môi trƣờng đƣợc mix đều và thông khí sử dụng không khí đƣợc lọc theo luồng 170l/giờ cung cấp bởi bơm. Sử dụng ánh sáng huỳnh quang 40W cung cấp 31.35µmol photon m-2s-1 . Việc nuôi cấy đƣợc duy trì trong nhà kính dƣới ánh sáng 12h sáng/ 12 h tối ở 2 điều kiện nhiệt độ nêu trên.
Để xem xét sự thay đổi của sinh khối, cứ 24h lại lấy mẫu ra bằng kĩ thuật vô trùng. Cho đến ngày cuối nuôi cấy, môi trƣờng nhân lên cho mỗi thí nghiệm phân đoạn, lọc, rửa với nƣớc cất để loại bỏ muối tan, ly tâm 15000rpm, làm đông khô và giữ ở -20oC cho định lƣợng protein, lipid và các hợp chất phenol.
Phƣơng pháp phân tích: Nồng độ sinh khối đƣợc đinh lƣợng ở OD 670nm để tạo 1 thang chuẩn liên quan dến khối lƣợng khô S. platensis với số đo OD, sau đó sẽ đƣợc dùng để định lƣợng mẫu nhanh. Hàm lƣợng đƣợc tính bằng phƣơng trình P= (Xi- Xo)/ti với P= sản lƣợng( mg/l/ ngày) Xo là lƣợng ban đầu (mg/l) và Xi là lƣợng thu đƣợc tại thời điểm I và ti là thời gian giữa Xo và Xi.
Protein đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp Kjeldahl.
Lipid đƣợc định lƣợng nhờ sử dụng phƣơng pháp Folch bằng sửu dụng hỗn hợp 2 chloroform: 1 methanol.
Các hợp chất phenol đƣợc định lƣợng bằng methanol , theo sau bởi sự chia các hexane và kết tuả các chất không phải phenol với Ba(OH)2 và ZnSO4. Tổng lƣợng phenol đƣợc định lƣợng bằng máy đo OD với phƣơng pháp Folin sử dụng tyrosine nhƣ là thang chuẩn.
Kết quả:
Sự sinh trƣởng ở 30 độ và 37 độ đƣợc chỉ ra trong hình III.2.4. Nhìn chung thì ở 30 độ thu đƣợc sinh khối lớn hơn 37 độ.
42
Các giá trị: tốc độ sinh trƣởng tối đa (µmax) khoảng thời gian của phase cấp số nhân (∆t) , sản lƣợng ở 450h (P450) và hàm lƣợng protein, lip, hợp chất phenol đƣợc chỉ ra trong Bảng 19.
Nhìn chung, sinh khối và µmax cao hơn ở 35 độ. Giá trị p chỉ ra nồng độ của sodium nitrate trong môi trƣờng Zarrouk và có ảnh hƣởng đến sự sản xuất protein , lipid và các phenolic, trong khi nhiệt độ có ảnh hƣởng lên tất cả các biến số.
Hình 6: Mật độ sinh khối của S. Platensis trong môi trường có nồng độ sodium nitrate khác nhau (a) 30 độ C (b) 35 độ C. Nồng độ sodium nitrate 0.625 , 1.250 ,
1.875 and 2.500 g /l
Bảng 19: Phân tích các giá trị khác nhau khi điều chỉnh từng yếu tố và tích hợp cả 2 yếu tố nhiệt độ và nồng độ nito
Hàm lƣợng protein thu đƣợc cao nhất ở nồng độ 1.875g/l ở cả 2 loại môi trƣờng, tuy nhiên ở cùng nồng độ đó, nhiệt độ 35 độ lại cho hàm lƣợng protein cao
43
hơn (hình 7.) Nồng độ lipd nhìn chung ở 35 độ cao hơn 30 độ và ở 2 nồng độ cuối gần nhƣ tƣơng tự nhau. Hàm lƣợng phenol ở 30 độ có sự dao động lên xuống qua các nồng độ nhƣng cao nhất ở nồng độ cuối trong khi đó , ở 35 độ hàm lƣợng này nhìn thấy rất thấp ở 2 nồng độ đầu tiên và tăng vọt lên ở 2 nồng độ cuối với giá trị tƣơng đƣơng.
Hình 7: Hàm lượng các chất trong môi trường nuôi cyy có nồng độ nito khác nhau dưới ảnh hưởng nhiệt độ khác nhau.(a) protein (b) lipid (c) các hợp chất phenol.
Nhƣ vậy, trong thí nghiệm này, chủng S. platensis phát triển và cho các sản phẩm hàm lƣợng cao ở 35 độ C với nồng độ sodium nitate ở 1.875g/l hay 2.5g/l.
44
Việc sản xuất Spirulina đƣợc nuôi cấy trên các quy mô lớn hơn, có thể xây dựng lên các trang trại tốn kém hay cũng có thể nuôi trên các bể xử lí nƣớc thải (Hình 8).
4. 2.1.2. Ứng dụng của SCP Spirulina
Nhƣ nguồn thực phẩm bổ sung protein.
Các sản phẩm chức năng (ví dụ nhƣ thực phẩm dùn cho ngƣời bị béo phì hay là các sản phẩm cung cấp vitamin dƣới dạng bột, viên…)
Các loại thuốc điều trị tự nhiên: sử dụng nhiều trong phòng ngừa các bệnh, nhƣ giảm tỷ lệ cholesterol trong cơ thể, giảm lƣợng đƣờng trong máu của bệnh nhân tiểu đƣờng do có axit gamma linoleic… là nguồn cung cấp vitamin A giúp sáng mắt và có chứa các carotene nhƣ là chất chống ung thƣ…
Hình 8 Một số mô hình nuôi trồng Spirulina (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong mĩ phẩm: do sản phẩm Spirulina có chứa hàm lƣợng protein và vitamin A và B cao, nên có thể duy trì mái tóc khỏe mạnh… hay sắc tố phycocyanin giúp tạo
45
các son môi và mặt nạ dƣợc thảo của Nhật… chúng có thể thay thế các chất trong thuốc nhuộm mà gây ung thƣ.
4.2.2. Sản xuất SCP từ tảo Chlorella
Tảo Chlorella là một chi của tảo xanh đơn bào, thuộc về ngành Chlorophyta. Chlorella có dạng hình cầu, đƣờng kính khoảng 2-10 μm và không có tiên mao.Chlorella có màu xanh lá cây nhờ sắc tố quang hợp chlorophyll -a và b trong lục lạp.Thông qua quang hợp nó phát triển nhanh chóng chỉ cần lƣợng khí carbon dioxide, nƣớc, ánh sáng mặt trời, và một lƣợng nhỏ các khoáng chất để tái sản xuất.
Thành phần hóa học:
- Tảo có chứa 65-68 % protein, 17% đƣờng (glucan), 6% chất béo(Axit béo) - Vitamin A gấp 5,8 lần cà rốt
- B1 gấp 1,3 lần men vô cơ - B2 gấp 35 lần sữa
- Sắt gấp 13 lần gan lợn, 45 lần nho - Chất xơ gấp 1,5 lần khoai lang - Canxi Gấp 1,6 lần sữa
Đây là loại tảo cũng đƣợc sản xuất phổ biến rộng rãi, sau Spirulina. Mặc dù việc sản xuất của Chlorella nhìn đầy hứa hẹn và có liên quan đến công nghệ sáng tạo, nó sẽ không chứng minh đƣợc hiệu quả kinh tế trên thị trƣờng. Trong cuộc cạnh tranh với Spirulina và các sản phẩm nhƣ đậu nành, ngũ cốc, nó kém thành công hơn trên thị trƣờng thực phẩm phục vụ cho sức khỏe.
Trong thực tế, Chlorella đã không đƣợc thu hoạch dễ dàng với giá rẻ nhƣ dự