- Thí nghiệm 1: từ tháng 8/2008 – 12/2008 - Thí nghiệm 2: từ tháng 2/2010 – 6/2010 - Thí nghiệm 3: từ tháng 1/2009 – 5/2009 - Thí nghiệm 4: từ tháng 10/2009 – 02/2010 2.1.2. Địa điểm
- Ấp Xóm Chùa – xã Tân An Hội – huyện Củ Chi – Tp. HCM
- Phòng Nghiên cứu Sinh thái nước – Chi nhánh phía Nam – TTNĐ Việt - Nga - Khoa Sinh - Đại học Sư phạm Tp. HCM
2.2. Vật liệu thí nghiệm
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: cá chép Nhật (cá chép KOI – Cyprinus carpio)
Cá chép nhật giống, dạng đuôi dài (Butterfly Koi) được mua từ các trại sản xuất cá cảnh, với số lượng 1.000 - 1.200con / thí nghiệm. Cá được thả vào bể hai tuần trước khi thí nghiệm và cho ăn cùng một loại thức ăn để cá thích nghi với điều kiện môi trường, thức ăn và sức khỏe ổn định.
Tuyển chọn cá có màu gần giống nhau (đồng nhất một màu vàng hoặc cam) chất lượng tốt, bơi lội nhanh nhẹn, kích cỡ đồng đều (8 – 10g) để bố trí thí nghiệm 1 và 3.
Trên cơ sở kết quả thí nghiệm 1 và 2, đồng thời qua góp ý của Hội đồng Khoa học, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát sơ bộ thị trường cá cảnh Tp. HCM, cũng như thăm dò thị hiếu của một số người nuôi cá chép Nhật trên địa bàn thành phố về màu sắc được ưa chuộng nhất của cá chép Nhật. Kết quả cho thấy màu sắc cá chép Nhật được ưa chuộng là màu vàng cam và trắng. Vì vậy, đề tài đã chọn cá chép Nhật có màu vàng cam để bố trí thí nghiệm 2 và 4. Tiêu chuẩn lựa chọn cá thí nghiệm cũng tương tự như thí nghiệm 1 và 3.
2.2.2. Thức ăn thí nghiệm
Thức ăn dùng trong nghiệm thức đối chứng là loại thức ăn cho cá giống đang được các trại nuôi cá chép nhật sử dụng, do Công ty Cargill sản xuất, có hàm lượng protein tối thiểu là 30 %.
Lượng thức ăn dùng cho thí nghiệm được ước tính theo Lovell T., 1998 [13] (xem phụ lục).
Thức ăn dùng trong các nghiệm thức thí nghiệm được bổ sung thêm sắc tố bằng cách hòa tan sắc tố trong nước ấm (500C), sau đó phun đều lên thức ăn, hong khô trong không khí và trữ ở nhiệt độ thường. Các mẫu thức ăn được phân tích thành phần hoá học chủ yếu như vật chất khô, protein thô, béo, xơ thô và tro.
2.2.3. Các sắc tố carotenoid
Hai loại sắc tố carotenoid được sử dụng trong thí nghiệm là astaxanthin và canthaxanthin tổng hợp, có tên thương mại là: Carophyll Pink 10% và Carophyll Red 10% là sản phẩm của Công ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd. (Khu Công nghiệp Việt Nam – Singapore – Tỉnh Bình Dương)
Hình 2.1: Cấu trúc và thành phần của hạt CAROPHYLL ® Pink CWS
2.2.4. Bể thí nghiệm
- Thí nghiệm 1 & 3: sử dụng hệ thống bể cement, kích thước (2 x 3)m / bể. - Thí nghiệm 2 & 4: sử dụng hệ thống bể cement, kích thước (1 x 1)m / bể Nước cấp cho các bể thí nghiệm được tái sử dụng qua hệ thống lọc tuần hoàn. Các thông số chất lượng nước được kiểm tra hàng ngày, đảm bảo môi trường ổn định trong thời gian thí nghiệm.
Astaxanthin được nhũ hóa trong các chất chống oxy hóa Chất nền thực vật Tinh bột bắp CẤU TRÚC VÀ THÀNH PHẦN CỦA HẠT CAROPHYLL ® Pink CWS
Hình 2.2: Hệ thống bể thí nghiệm
2.3. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design – CRD).
2.3.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả cải thiện màu sắc cá chép Nhật của sắc tố astaxanthin tố astaxanthin
Thí nghiệm gồm 1 nghiệm thức đối chứng và 4 nghiệm thức thí nghiệm có bổ sung 25, 50, 75, 100mg astaxanthin / kg thức ăn. Các nghiệm thức thí nghiệm được ký hiệu lần lượt như sau:
Nghiệm thức A0 (ĐC) A25 A50 A75 A100
Astaxanthin (mg/kg) 0 25 50 75 100
Số lượng cá thí nghiệm 200 200 200 200 200
Trong thời gian thí nghiệm cá được cho ăn đến no, 2 lần/ngày. Lượng thức ăn được kiểm tra và điều chỉnh theo nhu cầu.
Thời gian thí nghiệm: 8 tuần
Trước khi bắt đầu thí nghiệm, thu mẫu 10 cá / nghiệm thức để đánh giá chỉ số màu sắc (pigmentation score). Trong quá trình thí nghiệm, cá được đánh giá chỉ số màu sắc 2 tuần / lần để theo dõi sự biến đổi màu sắc.
So sánh các kết quả thu được từ các nghiệm thức thí nghiệm, xác định liều bổ sung hiệu quả của astaxanthin vào thức ăn đối với cá chép Nhật.
Tiếp tục nuôi cá trong thời gian 8 tuần với thức ăn không có bổ sung sắc tố. Các chỉ tiêu theo dõi tương tự như trên. So sánh kết quả thu được để đánh giá sự ổn định của màu sắc trên da cá, từ đó xác định thời gian bổ sung astaxanthin vào thức ăn thích hợp nhất đối với cá chép Nhật.
TÓM TẮT PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Nghiệm thức A0 (ĐC) A25 A50 A75 A100
Astaxanthin (mg/kg) 0 25 50 75 100
Số lượng cá thí nghiệm 200 200 200 200 200
Thu mẫu 10 cá/nghiệm thức → đánh giá chỉ số màu sắc
Cho cá ăn thức ăn có bổ sung Astaxanthin trong 8 tuần
Xác định hàm lượng Astaxanthin bổ sung hiệu quả nhất
Xác định thời gian bổ sung Astaxanthin thích hợp Cho cá ăn thức ăn cơ bản
(- Astaxanthin) trong 8 tuần
Đánh giá chỉ số màu sắc 2 tuần/lần để theo dõi sự biến đổi màu sắc Cá chép Nhật giống (8 – 10g),
dạng đuôi dài (Butterfly Koi)
Tuyển chọn cá có chất lượng tốt, đồng nhất màu vàng cam Bố trí thí nghiệm theo kiểu CRD
2.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định hàm lượng astaxanthin cần thiết để sắc duy trì màu sắc của cá thí nghiệm màu sắc của cá thí nghiệm
Kết quả thí nghiệm 1 đã xác định được hàm lượng bổ sung astaxanthin hiệu quả nhất đối với cá chép nhật là 78,22 ± 5,84mg/kg và chu kỳ thích hợp nhất là cho cá ăn thức ăn có bổ sung sắc tố liên tục trong 2 tháng sau đó ngưng 1 tháng và tiếp tục cho cá ăn lặp lại theo chu kỳ trên.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là liệu sau khi màu sắc cá đạt mức tối ưu (theo thị hiếu người nuôi) thì có thể duy trì màu sắc ấy bằng việc bổ sung một lượng sắc tố thích hợp mà ít tốn kém hơn cách 3 tháng thực hiện một đợt bổ sung với hàm lượng cao hay không, và nếu có thì hàm lượng astaxanthin bổ sung thích hợp sẽ là bao nhiêu. Để giải quyết vấn đề trên, đề tài đã bổ sung thêm thí nghiệm 2 nhằm mục đích xác định hàm lượng astaxanthin cần thiết để duy trì màu sắc của cá chép nhật sau khi đạt màu sắc tối ưu.
Phương pháp bố trí thí nghiệm 2 như sau:
- Trong 2 tháng đầu, cho cá chép Nhật ăn thức ăn có bổ sung astaxanthin với hàm lượng đã được xác định trong giai đoạn 1 là 78,22 ± 5,84mg/kg. Để thuận tiện cho việc bố trí thí nghiệm, hàm lượng astaxanthin được chọn trong thí nghiệm 2 là 80mg/kg.
- Trong 2 tháng tiếp theo, cho cá ăn thức ăn với hàm lượng astaxanthin bổ sung là 0, 20, 40, 60, 80 mg/kg.
Định kỳ 2 tuần thu mẫu 15 cá / nghiệm thức / lần để đánh giá cảm quan chỉ số màu sắc, nhằm xác định hàm lượng astaxanthin cần thiết cho việc duy trì màu sắc của cá.
Các nghiệm thức thí nghiệm được ký hiệu như sau:
Nghiệm thức A0 (ĐC) A80-0 A80-20 A80-40 A80-60 A80-80
0 80 80 80 80 80
Astaxanthin
(mg/kg) 0 0 20 40 60 80
2.3.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả cải thiện màu sắc cá chép nhật của sắc tố canthaxanthin tố canthaxanthin
Thí nghiệm gồm 1 nghiệm thức đối chứng và 4 nghiệm thức thí nghiệm có bổ sung 25, 50, 75, 100mg canthaxanthin / kg thức ăn. Các nghiệm thức thí nghiệm được ký hiệu lần lượt như sau:
Nghiệm thức C0 (ĐC) C25 C50 C75 C100
Canthaxanthin (mg/kg) 0 25 50 75 100
Số lượng cá thí nghiệm 200 200 200 200 200
Trong thời gian thí nghiệm cá được cho ăn đến no, 2 lần/ngày. Lượng thức ăn được kiểm tra và điều chỉnh theo nhu cầu.
Thời gian thí nghiệm: 8 tuần
Nội dung, mục tiêu và các chỉ tiêu theo dõi tương tự như thí nghiệm 1.
2.3.4. Thí nghiệm 4: Xác định hàm lượng canthaxanthin hiệu quả nhất đối với việc cải thiện màu sắc ở cá chép Nhật. việc cải thiện màu sắc ở cá chép Nhật.
Từ kết quả thí nghiệm 3 cho thấy hàm lượng 100mg/kg canthaxanthin bổ sung vào thức ăn có tác dụng cải thiện màu sắc của cá thí nghiệm rõ rệt nhất. Tuy nhiên, đây vẫn chưa là giới hạn tối ưu. Vì vậy, nhóm nghiên cứu tiếp tục bố trí thí nghiệm 4 với các hàm lượng cao hơn (từ 100 – 200mg/kg) nhằm xác định hàm lượng canthaxanthin bổ sung hiệu quả nhất.
Thí nghiệm gồm 1 nghiệm thức đối chứng và 5 nghiệm thức thí nghiệm có bổ sung 100, 125, 150, 175, 200mg canthaxanthin / kg thức ăn. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các nghiệm thức thí nghiệm được ký hiệu lần lượt như sau:
Nghiệm thức C0 (ĐC) C100 C125 C150 C175 C200 Canthaxanthin (mg/kg) 0 100 125 150 175 200 Số lượng cá thí nghiệm 150 150 150 150 150 150
Đây là thí nghiệm tiếp theo của thí nghiệm 3 nên nội dung, mục tiêu và các chỉ tiêu theo dõi tương tự như thí nghiệm 3.
2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan màu sắc của cá thí nghiệm
Trước khi bắt đầu thí nghiệm, và cứ sau 2 tuần thu mẫu 10 cá / lần (TN 1 & 3), 15 cá /lần (TN 2 & 4) để đánh giá chỉ số màu sắc (pigmentation score) của cá thí nghiệm theo phương pháp của Boonyaratpalin và Unprasert, 1989 (trích bởi Paripatananont T. và cs, 1999 [16])
Chỉ số màu sắc của cá được đánh giá bởi 3 người không biết về cách thức bố trí các nghiệm thức thí nghiệm.
Trên cơ sở phương pháp đánh giá chỉ số màu sắc của cá bằng cách cho điểm theo thang màu từ 0 (màu vàng nhạt) đến 9 (màu đỏ đậm) của Boonyaratpalin và Unprasert, 1989, bảng so màu dùng trong thí nghiệm được thiết kế như sau:
Hình 2.4: Bảng so màu để đánh giá màu sắc ở cá
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2.5. Các chỉ tiêu theo dõi
- Chỉ số màu sắc (Pigmentation score): 2 tuần / lần
- Quản lý chất lượng nước bằng cách theo dõi các chỉ tiêu nhiệt độ, pH, oxy hòa tan (DO), amonia (NH4+ ) hàng ngày.
- Thành phần hóa học của thức ăn: hàm lượng đạm thô, chất béo, xơ thô, tro, chất khô được phân tích khi bắt đầu thí nghiệm.
2.6. Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic centurion XV, sử dụng trắc nghiệm Duncan để so sánh sự khác nhau giữa trung bình của các nghiệm thức.
Sử dụng phương pháp phân tích đường cong gãy khúc (Broken line method analysis) và phân tích hồi quy để xác định liều lượng tối ưu của sắc tố đối với cá chép nhật [3] (xem phụ lục).
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA SẮC TỐ ASTAXANTHIN ĐỐI VỚI VIỆC CẢI THIỆN MÀU SẮC Ở CÁ CHÉP NHẬT
3.1.1. THÍ NGHIỆM 1: Đánh giá hiệu quả cải thiện màu sắc cá chép Nhật của sắc tố astaxanthin sắc tố astaxanthin
3.1.1.1. Các điều kiện thí nghiệm a. Quản lý chất lượng nước
Thí nghiệm được bố trí trong các bể cement, sử dụng hệ thống lọc nước tuần hoàn nên trong thời gian thực hiện thí nghiệm, tất cả các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, DO, ammonia giữa các bể tương đối ổn định, thích hợp cho sự sinh trưởng của cá (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Các thông số môi trường của thí nghiệm 1 Nhiệt độ
Thời gian
Max Min Dao động pH
DO (mg/l) Ammonia (mg/l) Từ tháng 8 – 9/2008 30,9 26,4 4,5 7,8 4,8 0,08 Từ tháng 9 – 10/2008 29,2 26,0 3,2 7,6 4,9 0,06 Từ tháng 10 – 11/2008 28,5 25,7 2,8 7,5 4,7 0,06 Từ tháng 11 – 12/2008 28,3 25,5 2,8 7,5 4,7 0,07
b. Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm
Mẫu thức ăn được phân tích thành phần hóa học tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích thí nghiệm – Sở Khoa học Công nghệ Tp.HCM. Kết quả phân tích cho thấy thành phần hóa học của các mẫu thức ăn ở các nghiệm thức thí nghiệm và đối chứng hầu như bằng nhau (Bảng 3.2)
Bảng 3.2: Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm 1
Thành phần hóa học Đơn vị tính (%) - Vật chất khô 88,88 ± 0,41 - Đạm thô 31,61 ± 0,13 - Béo thô 5,59 ± 0,11 - Xơ thô 6,78 ± 0,14 - Tro 10,15 ± 0,10
3.1.1.2. Ảnh hưởng của astaxanthin đối với việc cải thiện màu sắc cá chép Nhật
Trong thời gian thí nghiệm, cá chép nhật được cho ăn thức ăn có bổ sung astaxanthin với các hàm lượng khác nhau: 25, 50, 75 và 100mg/kg (25, 50, 75 và 100ppm). Trên cơ sở phương pháp đánh giá màu sắc của cá bằng cách cho điểm theo thang màu từ 0 đến 9 của Boonyaratpalin và Unprasert, 1989, trước khi bắt đầu thí nghiệm, và cứ sau 2 tuần thu mẫu 10 cá / lần để đánh giá chỉ số màu sắc của cá chép Nhật (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Chỉ số màu sắc của cá thí nghiệm 1
Chỉ số màu sắc (Pigmentation score) Thời gian kiểm tra
A0 (ĐC) A25 A50 A75 A100
Bắt đầu TN 3,8000a 3,7667a 3,8333a 3,8000a 3,7333a Tuần 2 3,7000a 3,9000ab 4,1000b 4,6000c 5,3000d Tuần 4 3,7000a 4,1000b 4,7000c 5,4000d 5,5000d Tuần 6 3,5000a 4,2000b 5,0000c 5,6000d 5,7000d Tuần 8 3,8000a 4,1000a 5,2667b 5,8000c 6,1000c Tuần 10 (- Astaxanthin) 3,9000a 4,1000a 5,0000b 5,6000c 5,9000c Tuần 12 (- Astaxanthin) 3,9000a 4,3000b 5,3000c 5,5000c 5,7000c Tuần 14 (- Astaxanthin) 4,0000a 4,3000a 5,3000b 5,4000b 5,6000b Tuần 16 (- Astaxanthin) 3,9000a 4,1000a 5,4000b 5,6000bc 5,9000c
Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự giống nhau là sai khác không có ý nghĩa thống kê (P>0,05)
Qua số liệu trình bày ở bảng 3.3 cho thấy:
Lúc bắt đầu thí nghiệm, chỉ số màu sắc (Pigmentation score) của da cá ở các nghiệm thức tuy có khác nhau về số lượng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Nói cách khác, màu sắc của cá lúc bắt đầu thí nghiệm là tương đối đồng nhất.
Sau khi cho cá ăn thức ăn có bổ sung astaxanthin với hàm lượng là 25; 50; 75; 100mg/kg, màu sắc của cá có khuynh hướng đậm dần tỉ lệ thuận với hàm lượng bổ sung của astaxanthin. Kết quả đánh giá cảm quan sau 2 tuần thí nghiệm cho thấy chỉ
số màu sắc của cá chép Nhật ở các nghiệm thức thí nghiệm (A25, A50, A75, A100) đều cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (A0) với các giá trị lần lượt là 3,90; 4,10; 4,60 và 5,30 so với 3,70. Điều này chứng tỏ astaxanthin có tác động tích cực đến việc cải thiện màu sắc ở cá chép Nhật (Đồ thị 3.1)
Đồ thị 3.1: Chỉ số màu sắc của cá chép Nhật được cho ăn thức ăn có bổ sung astaxanthin với hàm lượng 25, 50, 75, 100mg/kg thức ăn
Chỉ số màu sắc của cá ở nghiệm thức A25 trong suốt thời gian thí nghiệm luôn luôn có giá trị cao hơn nghiệm thức đối chứng, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Do đó, có thể kết luận với hàm lượng bổ sung 25mg astaxanthin / 1kg thức ăn chưa có hiệu quả cải thiện màu sắc ở cá chép Nhật.
Qua 8 tuần thí nghiệm, các nghiệm thức A50, A75, A100 có chỉ số màu sắc cao nhất với các giá trị lần lượt là 5,2667; 5,8000 và 6,1000 so với đối chứng là 3,8000. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Paripatananont T. và cs., 1999 về ảnh hưởng của astaxanthin đến màu sắc của cá vàng (Carassius auratus)
Tuy nhiên, chỉ số màu sắc của cá chép Nhật ở nghiệm thức A50 thấp hơn so với nghiệm thức A75 và A100 (P<0,05), trong khi ở cá vàng chỉ số màu sắc ở 3 nghiệm thức này không có khác biệt (P>0,05), đồng thời chỉ số màu sắc của cá chép
0 1 2 3 4 5 6 7 C h ỉ s ố m àu s ắ c 0 2 4 6 8 Tuần
A0 A25 A50 A75 A100
--a-- a