7. CÂY NHỌ NỒI VÀ VAI TRÒ CỦA WEDELOLACTONE TRONG QUÁ
2.1.3.4.Pha dung dịch chuẩn
Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 1000pg/ml và dung dịch Assay
Sau đó tiến hành pha về các dung dịch có nồng độ thấp hơn gồm: 500pg/ml; 250pg/ml; 125pg/ml; 62.5pg/ml; 31.3pg/ml; 15.6pg/ml
Dung dịch Assay đƣợc coi là có nồng độ 0pg/ml
Sau khi đã thu đƣợc các dung dịch có nồng độ chuẩn nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn là đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa lƣợng OD đo đƣợc và nồng độ thực tế của các cytokine
Máy đọc ELISA sẽ cho kết quả là lƣợng OD trong dung dịch mẫu sau quá trình bắt cặp đặc hiệu KN-KT. Kết quả này có đƣợc là do một chất hóa học đặc biệt đƣợc bổ sung trong kit, cho bƣớc sóng nhận biết đặc hiệu là 540nm. Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của cytokine
Các sai số trong phép đo đƣợc biểu thị thông qua hai lần xử lý số liệu:
- Sai số trong quá trình dựng đƣờng chuẩn biểu thị bằng sự sai lệch so với đƣờng tuyến tính
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh Lớp Cao học K18 25 Khoá 2009-2011 Conc 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 StandardCurve
Log-Log Fit: Log(y) = A + B * Log(x): A B R^2 Std (Standards: Conc vs MeanValue) -1.95 0.902 0.988
Hình 7: Đƣờng chuẩn của cytokine IL-6
Đối với phân tích khả năng sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm bằng zymosan trong BMDM bằng kít ELISA, ở đây là TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10. BMDMs đƣợc tách ra từ chuột đƣợc ủ cùng với LPS hoặc zymosan sau một số thời gian nhất định. Thu dịch sau khi ly tâm các mẫu tế bào. Sau đó các dịch này sẽ đƣợc đo nồng độ TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10 bằng kít ELISA (BD bioscience). Các thủ tục tiến hành đo cytokine sẽ đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà chế tạo kít ELISA. Nồng độ cytokine tiết ra từ các tế bào nuôi cấy sẽ đƣợc đánh giá thông qua khả năng hấp thụ ở bƣớc sóng 540 nm bằng máy ELISA.
Đối với đánh giá hoạt động kích thích viêm của Dectin-1 bằng zymosan, BMDMs đƣợc tiền sử lý cùng với Wedelolactone trong 1 giờ. Sau đó, các tế bào sẽ sử lý cùng với zymosan sau 18 giờ. Dịch các mẫu tế bào này đƣợc thu lại và ly tâm. Sau đó tiến hành đo nồng độ các cytokine giống nhƣ trên.
Đối với đánh giá ức chế hoạt động của Dectin-1, BMDMs đƣợc tiền sử lý cùng với laminarin (một chất có khả năng ức chế hoạt động của Dectin-1) hoặc với galactan (đối chứng với laminarin) trong 1 giờ. Sau đó, các mẫu tế bào này tiếp tục đƣợc ủ cùng với Wedelolactone. Sau 1 giờ, các mẫu tế bào này sẽ đƣợc sử lý cùng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 26 Khoá 2009-2011