7. CÂY NHỌ NỒI VÀ VAI TRÒ CỦA WEDELOLACTONE TRONG QUÁ
2.2.3.Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit
2.2.3.1. Giới thiệu về phương pháp
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme Immuno Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng các sản phẩm sinh học.
2.2.3.2. Nguyên tắc
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bƣớc cơ bản nhƣ sau
(1) Kháng nguyên – antigen (KN) chƣa biết đƣợc gắn trên một bề mặt
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trƣớc đƣợc "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này đƣợc gắn kết với enzyme
(3) Thêm vào một cơ chất; enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định đƣợc
2.2.3.3. Quy trình thí nghiệm
a. Áo đĩa bằng 100µl Capture antibody pha trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1/250. Ủ qua đêm ở 4°C
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 24 Khoá 2009-2011
c. Thêm 200µl/giếng dung dịch Assay. Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng d. Rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa
e. Bổ sung mẫu chuẩn có chứa kháng nguyên ở thể tích 100µl/ giếng. Ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng
f. Rửa mỗi giếng 5 lần bằng dung dịch rửa
g. Thêm 100µl/giếng dung dịch Working detector gồm: dung dịch Assay+ Detection antibody + Sav-HRP. Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng
h. Tiến hành rửa đĩa 7 lần bằng dung dịch rửa
i. Tiếp tục bổ sung 100µl dung dịch develope vào mỗi giếng. Ủ đĩa 30 phút ở trong bóng tối
j. Cuối cùng, thêm vào mỗi giếng 50µl dung dịch stop để dừng phản ứng Đọc bằng máy đọc ELISA Bio-rad, sử dụng bƣớc sóng 540 nm
2.1.3.4. Pha dung dịch chuẩn
Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 1000pg/ml và dung dịch Assay
Sau đó tiến hành pha về các dung dịch có nồng độ thấp hơn gồm: 500pg/ml; 250pg/ml; 125pg/ml; 62.5pg/ml; 31.3pg/ml; 15.6pg/ml
Dung dịch Assay đƣợc coi là có nồng độ 0pg/ml
Sau khi đã thu đƣợc các dung dịch có nồng độ chuẩn nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn là đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa lƣợng OD đo đƣợc và nồng độ thực tế của các cytokine
Máy đọc ELISA sẽ cho kết quả là lƣợng OD trong dung dịch mẫu sau quá trình bắt cặp đặc hiệu KN-KT. Kết quả này có đƣợc là do một chất hóa học đặc biệt đƣợc bổ sung trong kit, cho bƣớc sóng nhận biết đặc hiệu là 540nm. Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của cytokine
Các sai số trong phép đo đƣợc biểu thị thông qua hai lần xử lý số liệu:
- Sai số trong quá trình dựng đƣờng chuẩn biểu thị bằng sự sai lệch so với đƣờng tuyến tính
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh Lớp Cao học K18 25 Khoá 2009-2011 Conc 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 StandardCurve
Log-Log Fit: Log(y) = A + B * Log(x): A B R^2 Std (Standards: Conc vs MeanValue) -1.95 0.902 0.988
Hình 7: Đƣờng chuẩn của cytokine IL-6
Đối với phân tích khả năng sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm bằng zymosan trong BMDM bằng kít ELISA, ở đây là TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10. BMDMs đƣợc tách ra từ chuột đƣợc ủ cùng với LPS hoặc zymosan sau một số thời gian nhất định. Thu dịch sau khi ly tâm các mẫu tế bào. Sau đó các dịch này sẽ đƣợc đo nồng độ TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10 bằng kít ELISA (BD bioscience). Các thủ tục tiến hành đo cytokine sẽ đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà chế tạo kít ELISA. Nồng độ cytokine tiết ra từ các tế bào nuôi cấy sẽ đƣợc đánh giá thông qua khả năng hấp thụ ở bƣớc sóng 540 nm bằng máy ELISA.
Đối với đánh giá hoạt động kích thích viêm của Dectin-1 bằng zymosan, BMDMs đƣợc tiền sử lý cùng với Wedelolactone trong 1 giờ. Sau đó, các tế bào sẽ sử lý cùng với zymosan sau 18 giờ. Dịch các mẫu tế bào này đƣợc thu lại và ly tâm. Sau đó tiến hành đo nồng độ các cytokine giống nhƣ trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối với đánh giá ức chế hoạt động của Dectin-1, BMDMs đƣợc tiền sử lý cùng với laminarin (một chất có khả năng ức chế hoạt động của Dectin-1) hoặc với galactan (đối chứng với laminarin) trong 1 giờ. Sau đó, các mẫu tế bào này tiếp tục đƣợc ủ cùng với Wedelolactone. Sau 1 giờ, các mẫu tế bào này sẽ đƣợc sử lý cùng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 26 Khoá 2009-2011
với zymosan. Dịch tế bào các mẫu thu đƣợc đem ly tâm và đánh giá nồng độ cytokine giống nhƣ trên.
2.2.4. Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa
BMDMs đƣợc sử lý cùng với Laminarin hoặc galactan trong 60 phút, và tích lũy với zymosan sau khi đã đƣợc ủ với không hoặc cùng với Wedelolactone trong 60 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc ủ với chất huỳnh quang (DHE) trong 15 phút ở 37◦C trong 5% CO2. Những tế bào này sẽ đƣợc kiểm tra bằng laser-scanning confocal microscopy (LSM 510) để xác định mật độ khác nhau của ROS trong các mẫu đã đƣợc xử lý.
Quá trình phospho hóa của p47phox. BMDMs đƣợc xử lý nhƣ phần đánh giá khả năng của Wedelolactone đối với MAPKs, ở đây chỉ thay kháng thể thứ nhất bằng p47 và ser345.
2.2.5. Gây nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở chuột bằng tiêm zymosan zymosan
Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc thực hiện gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn. Chuột sẽ đƣợc tiêm zymosan (2mg/g trọng lƣợng cơ thể) đã đƣợc hòa tan trong đệm phosphate-buffered saline (PBS). Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ trong 5 ngày sau khi tiêm zymosan.
2.2.6. Đánh giá hiệu quả sống xót của chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trong chuột bằng Wedelolactone nhiễm trùng trong chuột bằng Wedelolactone
Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần ( khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc chia thành các nhóm khác nhau (mỗi nhóm 10 con) bao gồm 4 nhóm:
Nhóm 1: chuột đƣợc tiêm DMSO (đối chứng âm)
Nhóm thứ 2: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone (10mg/kg trọng lƣợng cơ thể, Wedelolactone đƣợc hòa trong DMSO)
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 27 Khoá 2009-2011
Nhóm thứ 3: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone (20mg/kg trọng lƣợng cơ thể) Nhóm thứ 4: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone (30mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Sau đó, chuột đƣợc gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn bằng tiêm zymosan (2mg/kg trọng lƣợng cơ thể) đã đƣợc hòa tan trong đệm phosphate-buffered saline (PBS). Wedelolactone đƣợc hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO). Chuột sẽ đƣợc đánh giá trong 5 ngày kể từ khi đƣợc xử lý cùng với Wedelolactone. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ.
2.2.7. Đánh giá hiệu quả ức chế quá trình sinh cytokine trong huyết thanh của Chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone Chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bằng tiêm Wedelolactone
Chuột sau khi đƣợc thực hiện thí nghiệm nhƣ 2.2.8 sẽ đƣợc lấy máu. Sau đó, máu đƣợc ly tâm và lấy phần huyết thanh để tiến hành phân tích TNF-α, IL-6 bằng phƣơng pháp ELISA nhƣ trên.
2.2.8. Đánh giá hiệu quả Wedelolactone và Dexamethason trong điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng
Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần ( khoảng 18-22 gram) sẽ đƣợc chia thành 3 nhóm (mỗi nhóm 10 con):
Nhóm 1: chuột đƣợc tiêm DMSO (đối chứng âm), Nhóm thứ 2: chuột đƣợc tiêm Wedelolactone
Nhóm thứ 3: chuột đƣợc tiêm Dexamethasone (1mg/kg trọng lƣợng cơ thể)
Sau đó, chuột đƣợc gây nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn theo 2.2.5. Chuột sẽ đƣợc đánh giá trong 5 ngày kể từ khi đƣợc sử lý cùng với zymosan. Khả năng sống của chuột đƣợc đánh giá sau 5 tiếng đối với 40 giờ đầu và sau đó là 10 giờ.
2.2.9.Phân tích thống kê
Đối với phân tích thống kê, các số liệu đƣợc lấy từ các kết quả độc lập, đƣợc thể hiện ý nghĩa bằng ± SD và đƣợc phân tích bằng student’s t-test cùng với điều chỉnh Bonferroni hoặc ANOVA đối với nhiều phép so sánh. Sự khác nhau sẽ đƣợc chỉ ra ý nghĩa bằng P< 0.05.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh Lớp Cao học K18 28 Khoá 2009-2011 25 50 75 100 Tỷ lệ tế bào sống (%) ĐC 10 20 30 (μg/ml )
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hƣởng bởi Wedelolactone
Để khẳng định Wedelolactone có gây độc tố đối với tế bào BMDM hay không, BMDM đƣợc chia đều vào các giếng khác nhau trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ 1x 105. Các BMDM này đƣợc xử lý với Wedelolactone ở các nồng độ khác nhau nhƣ trên hình 8. Sau đó, BMDM đƣợc ủ cùng với 10 μl kit đếm tế bào. Kết quả đƣợc chỉ ra ở trên hình 8, tỉ lệ phần trăm của các BMDMs không có sự khác biệt giữa BMDMs đƣợc xử lý với các nồng độ khác nhau của Wedelolactone sau 48 giờ. Kết quả này, cho thấy Wedelolactone không có khả năng gây độc với BMDM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 8: Wedelolactone không gây độc đối với tế bào BMDM
BMDMs được nuôi với mật độ 1×105
tế bào/ giếng. Sau 3-4 ngày, các tế bào này được xử lý cùng với Wedelolactone ở các nồng độ lần lượt là 10, 20, 30 μg/ml. Các tế bào
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 29 Khoá 2009-2011
2. Đánh giá khả năng zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine
Để xác định việc kích thích quá trình sinh các cytokine tiền viêm và kháng viêm của BMDM bằng zymosan, BMDM sau khi đã đƣợc nuôi trong đĩa 48 giếng với mật độ là 1x105
sẽ đƣợc ủ với zymosan (100 µg/ml) ở các thời gian khác nhau nhƣ trên hình 9. Nhƣ vậy, zymosan (100µg/ml) kích thích BMDM, sinh cytokine TNF-α , IL- 6, IL-12p40, IL-10 tăng dần từ mốc 0h , 4h ,8h , 18h sau đó bắt đầu giảm. Từ kết quả này, chỉ ra rằng thời gian ủ zymosan để sinh ra cytokine nhiều nhất là sau 18 giờ
Nồng độ cytokine (pg/ml) Nồng độ cytokine (pg/ml)
Hình 9: Zymosan kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm.
BMDMs từ chuột được ủ với zymosan 100 (µg/ml). Dịch tế bào được ủ với zymosan ở các thời gian khác nhau lần lượt là 0, 4, 8, 18, 48 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA.. Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập. 0 5000 10000 15000 0 4 8 18 48 (h) 0 4000 8000 12000 4 8 18 48 (h) 0 2000 4000 8000 10000 0 4 8 18 48 (h) 0 5000 10000 15000 0 4 8 18 48 (h) IL-6 TNF-α IL12p40 IL-10 0 5000 10000 15000 0 4 8 18 48 (h) 0 4000 8000 12000 4 8 18 48 (h) 0 2000 4000 8000 10000 0 4 8 18 48 (h) 0 5000 10000 15000 0 4 8 18 48 (h) IL-6 TNF-α IL12p40 IL-10
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 30 Khoá 2009-2011
3. Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích thích bởi zymosan kích thích bởi zymosan
Wedelolactone có khả năng làm giảm sốt, chống ung thƣ. Tuy nhiên, vai trò của nó trong quá trình truyền tín hiệu viêm gây ra bởi zymosan vẫn chƣa đƣợc chứng minh. Để đánh giá hiệu quả Wedelolactone trong quá trình này, BMDM đã đƣợc ủ với các nồng độ khác nhau của Wedelolactone trong 45 phút. Sau đó, BMDM đƣợc ủ tiếp với zymosan sau 18 giờ. Từ hình 10 cho thấy Wedelolactone đã ức chế quá trình sản xuất cytokine tiền viêm TNF, IL-6, IL12p40. Trái lại, đối với protein kháng viêm IL-10 thì Wedelolactone lại không có khả năng ức chế. Từ kết quả này cho thấy với nồng độ 20µg/ml thì wedelolactone cho hiệu quả tốt nhất.
Nồng độ cytokine (pg/ml) Nồng độ cytokine (pg/ml)
Hình 10: Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích thích bằng zymosan 0 4000 8000 12000 DM 2.5 5 10 20 µg/ml TNF-α W zymosan 0 5000 10000 15000 IL-6 W zymosan DM 2.5 5 10 20 µg/ml 0 4000 8000 12000 DM 2.5 5 10 20 µg/ml IL-12p40 W 0 4000 8000 12000 IL-10 W zymosan DM 2.5 5 10 20 µg/ml zymosan
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 31 Khoá 2009-2011
BMDMs từ chuột được ủ cùng với W (20 µg/ml), hoặc đối chứng DMSO (0.1% DMSO) trong 45 phút trước khi ủ với zymosan 100 (µg/ml). Dịch sau sau khi tế bào được ủ với zymosan 18 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA. Dịch thu được sau 18 giờ sẽ đánh giá bằng phân tích ELISA . Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập. DM, media control; W, Wedelolactone; Dex.
4. Wedelolactone điều hòa quá trình sinh cytokine tiền viêm thông qua thụ thể Dectin-1
Thụ thể Dectin-1 tham gia chính trong quá trình nhận dạng miễn dịch ban đầu của nấm thông qua liên kết glucan [59]. Do đó, Wedelolactone đã đƣợc điều tra xem có khả năng ức chế quá trình sản xuất cytokine do zymosan kích thích. Đối với mục đích này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với một số nồng độ tăng dần của laminarin, một chất có khả năng ức chế quá trình hoạt động của thụ thể Dectin-1 [27], hoặc polysaccharide galactan ở các nồng độ giống nhƣ laminarin sau 45 phút. Tiếp theo, các tế bào đƣợc ủ cùng với Wedelolactone (hình 11A), Dex (hình 11B) trƣớc khi ủ với zymosan. Tế bào ủ cùng với Laminarin xuất hiện quá trình sinh ra cytokine ngƣợc lại với tế bào không sử lý với Laminarin ở hình 11A. Các cytokine TNF-α, và IL-6 trong BMDMs đã tăng dần theo nồng độ của Laminarin. Trái lại, các tế bào đƣợc sử lý cùng với polysaccharide galactan vẫn cho kết quả giống nhƣ tế bào đƣợc sử lý với Wedelolactone. Giống nhƣ kết quả hình 11A, các kết quả trên hình 11B cũng cho kết quả tƣơng tự. Những kết quả này gợi ý rằng thụ thể Dectin-1 có một vai trò cơ bản trong quá trình Wedelolactone và Dex truyền đi quá trình ức chế zymosan kích thích sinh ra cytokine tiền viêm trong BMDMs.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 32 Khoá 2009-2011
Hình 11: Wedolactone hoặc Dex điều hòa quá trình đáp ứng viêm kích thích bằng zymosan thông qua thụ thể dectin-1.
BMDMs đã được ủ ban đầu cùng với chất đối vận thụ thể Dectin-1 ở các nồng độ laminarin (0,1, 0,25, 0,5 mg/ml), polysaccharide galactan (0,1, 0,25, 0,5 mg/ml) hoặc với dung môi đối chứng (0.1% DMSO) trong 60 phút trước khi sử lý Wedelolactone (20 µg/ml) (ở hình A) hoặc Dex (100 nM) (ở hình B) trong 45 phút. Dịch tế bào lấy được sau khi ủ với zymosan sẽ được đánh giá cytokine bằng phương pháp ELISA. Kết quả thí nghiệm chỉ sự sai số trong 5 thí nghiệm độc lập. Dung dịch môi trường, M; Dung môi đối chứng, ĐC; Wedelolactone, W; Dexamethasone, Dex; Zymosan, Zym; Laminarin, Lam; Galactan, Gal.
5. Wedelolactone điều khiển quá trình sinh ROS do zymosan kích thích thông qua thụ thể Dectin-1
Zymosan có thể kích thích quá trình sản xuất ROS trong đại thực bào [16]. Tuy nhiên, vai trò của Wedelolactone trong quá trình sinh ROS do zymonsan kích thích trong BMDB vẫn chƣa rõ. Để điều tra quá trình này, BMDMs đã đƣợc ủ cùng với Laminarin hoặc Galactan trong 60 phút trƣớc khi ủ với Wedelolactone (20g/ml) hoặc Dex (100nM). Sau đó, các tế bào này đƣợc ủ tiếp với zymosan trong 30 phút. Các tế bào này tiếp tục đƣợc ủ với DHE theo nhƣ phần phƣơng pháp. Nhƣ chỉ ra ở
Zym Khả năng sinh cytokine (ng/ml) W lam gal TNF- IL-12p40 0 4800 1200 2400 3600 TNF- 0 8000 2000 4000 6000 IL-6 0 800 200 400 600 IL-12p40 lam gal M ĐC ĐC W Dexa A B 0 4800 1200 2400 3600 0 8000 2000 4000 6000 IL-6 0 800 200 400 600 M ĐC ĐC ** (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 33 Khoá 2009-2011
hình 12A, zymosan đã kích thích tạo ra ROS, tuy nhiên quá trình sản xuất ROS đã bị ức chế bởi tế bào đƣợc ủ với Wedelolactone nhƣng quá trình này bị đảo ngƣợc đối với tế bào đƣợc ủ với Laminarin. Tuy nhiên, điều này không xảy ra với tế bào