L ỜI CAM ĐOAN
3.1.6. Nghiên cứu tái sinh chồi
Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh trên đối tượng cây khoai tây cho thấy, thành phần môi trường ảnh hưởng rất đáng kê tới quá trình tạo callus từ mẫu nuôi cấy. Tu y vậy, quá trình tái sinh chồi từ callus là tương đối đơn giản, không bị chi phối nhiều bởi các yếu tố môi trường [16].
Vì thế, callus tạo thành trên môi trường tạo callus được chúng tôi cấy chu yển sang môi trường tạo chồi SM có thành phần gồm SM = MS + 2 mg/1 BAP + 1 mg/l kinetin + 400 mg/1 (CH) + 30 g/1 xaccarozơ +100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar.
Ket quả tái sinh chồi từ mẫu callus tạo thành từ đoạn thân /mẫu lá được trình bày trên bảng 3.11.
Báng 3.11. Tái sinh chồi từ mẫu callus tạo thành từ đoạn thân /mẫu lá kh o ai tây
Attlantic
Dạng mẫu ban đầu
Số mẫu callus nuôi cấy
Số chồi tạo thành Tỉ lệ tạo chồi (%)
Mầu lá 90 5 5,55
Đoạn thân 90 58 64,44
Kết quả bảng 3.11 cho thấy chồi tái sinh thu được thông qua callus tạo thành từ đoạn thân nuôi cấy cho số lượng tương đối lớn, đạt 64,44%. Trong khi đó. từ mẫu callus của lá nuôi cấy, chúng tôi nhận được rất ít chồi tái sinh, chồi tạo thành có hình thái không bình thường, ở dạng đoạn ngắn xốp, không xuất hiện lá. Như vậy, chúng tôi chỉ có thê tái sinh chồi từ callus của các mẫu đoạn thân nuôi cấy.
8 tuần
2 tuân
í ì
4 tuần
Hinh3.ll. Tải sinh chồi từ mâu callus tạo thành từ đoạn thân cây khoai tây
3.2. Nghiên cứu chuyển gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens
3.2.1. Lựa chọn chủng vi khuân A. tumefaciens thích hợp cho chuyên gen ở giống khoai tây Atlantic.
Các chủng gốc Agrobacterium tumefaciens khác nhau có đặc điêm di tru yền khác
nhau dẫn tới khả năng xâm nhiễm và cài gen vào tế bào thực vật của chúng cũng khác
nhau. Do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các chủng A.
tumefaciens khác nhau tới khả năng chu yến gen chỉ thị vào giống khoai tây Atlantic.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các chủng vi khuân A. tumefaciens
EHA101, C58 và AGL-1 mang vectơ chu yển gen pCAMBIA1301 để lây nhiễm với các đoạn thân, lá của giống khoai tây Atlantic. Mầu đoạn thân, mẫu lá được cắt ra từ các cây khoai tây nuôi cấy trên môi trường nhân NC sau 2-3 tuần nuôi cấy. Ket quả thí nghiệm
được trình bày ở bảng 3.12 Bảng 3.12. Lựa chọn chủng vỉ khuân thích hợp cho chuyên gen ở
giông khoai tây
At tỉ antic
CT
Chủng vi khuẩn
Mầu lá Đoạn thân
Tỷ lệ biêu hiện gen gus (%) Mức độ biểu hiện Tỷ lệ biêu hiện gen gus (%) Mức độ biêu hiện
1 AGL-1 83,33 Đậm vừa 80,55 Đậm vừa
2 C58 77,77 Đậm vừa 79,44 Đậm vừa
3 EHA 101 20,55 Nhạt 28,33 Nhạt
Đ/C - 0 - 0 -
Ket quả ở bảng 3.12 cho thấy: Ớ công thức đối chứng (Đ/C) không có vi khuân mà
thay vào đó là môi trường LB không cho biêu hiện màu xanh chàm của gen gus sau khi
nhuộm X-gluc ở mẫu lá và đoạn thân, dịch nhuộm trong suốt. Như vậy kết quả thí nghiệm hoàn toàn đáng tin cậy, hiện tượng dương tính giả bị loại trừ. Trong sô 3 chủng vi khuân sử
dụng trong thí nghiệm thì chủng vi khuân AGL-1 cho tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen gus ở
mẫu lá khoai tây đạt cao nhất 83,33% mức độ biếu hiện màu xanh chàm đậm vừa. Tỷ lệ
biểu hiện tạm thời của gen gus ở chủng C58 sai khác không nhiều 77,77%. Chủng EHA 101 cho tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus thấp nhất 20,55% mức độ biếu hiện nhạt hơn so
với các chủng vi khuấn còn lại. Do đó chúng tôi lựa chọn chủng AGL-1 cho các thí nghiệm chu yên gen tiêp theo.
58 A í 5S i ề # • tf 4 * • ị* $ỖỈ « **«* AGL-1
//m/z 3.72. Biêu hiện tạm thời của gen gus trên mâu lả khoai tây Atlantic sau khi lây
nhiêm với các chủng vỉ khuân A. tumefaciens khác nhau.
Hình 3.13. Biêu hiện tạm thời của gen gus trên đoạn thân khoai tây Atlantic sau khi lây nhiêm với các chủng vi khuân A. tumefaciens khác nhau.
Nghiên cứu của Beaujean và cộng sự (1998) đã xây dựng được qu y trình chu yển gen có hiệu quả cao ở 3 giống khoai tây Desiree, Bintje và Kaptah Vanđel sử dụng
chủng A. tumefaciens C58 mang vector pGS Glue 1. Điều này cho thấy việc lựa chọn chủng
A. tumefaciens thích hợp cho biến nạp vào cây khoai tây phụ thuộc nhiều vào giống (kiêu
gen) [21].
Với các mẫu đoạn thân được biến nạp với chủng EHA101 cho biếu hiện màu xanh chàm
của gen gus yếu, có màu xanh nhạt, tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen gus thấp nhất đạt
28,33%. Mầu đoạn thân được lây nhiễm với chủng AGL-1 chúng tôi quan sát thây mức độ
biêu hiện gen gus khá đậm, tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus đạt cao nhất là 80,55%. Đối với chủng C58, tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus sai khác không nhiều so với chủng
AGL-1 (đạt 79,44%), tu y nhiên mức độ biếu hiện 2en gus kém hơn. Do đó chủng AGL-1
được chúng tôi lựa chọn cho các thí nghiệm chu yên gen tiêp theo vào cây khoai tây Atlantic.
3.2.2. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyến gen vào cây khoai tây thông qua vi khuân A. tumefaciens
Hai vector được sử dụng trong thí nghiệm này là p6d35S-GUS và pCAMBIA 1301.
Chủng vi khuân A. tumefaciens AGL-1 mang vector p6d35S-GƯS (ký hiệu là AA39); và
chủng AGL-1 mang vector pCAMBIA1301 (ký hiệu là AA43) được sử dụng đế lây nhiễm với các đoạn thân, lá của giống khoai tây Atlantic. Mầu đoạn thân, mẫu lá được cắt ra từ các cây khoai tây nuôi cấy trên môi trường nhân NC sau 2-3 tuần nuôi cấy. Ket quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.13
Bảng 3.13. Lựa chọn vector thích họp cho chuyên gen vào mâu lá cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuân A. tumefaciens
CT Vector
Tỷ lệ biêu hiện tạm thời của
gen gus (%)
Mức độ biểu hiện
Đ/c 0 0 0
1 p6d35S-GƯS 64,44 Đậm vừa
2 pCAMBIA 1301 35,55 Hơi đậm
Từ kết quả trên bảng 3.13 cho thấy: Sử dụng vector p6d35S-GUS cho hiệu quả chuyến
gen cao hơn, mức độ biêu hiện tạm thời của gen gus đối với mẫu lá đạt 64,44% với vùng
biếu hiện rộng, mức độ biếu hiện đậm vừa. Trong khi sử dụng vector pCAMBIA 1301 đạt tỷ lệ thấp hơn 35,55%, mức độ biếu hiện màu xanh
60
chàm nhạt hơn. Ớ thí nghiệm đối chứng chúng tôi sử dụng môi trường LB không có vi
khuấn, và đã không quan sát thấy màu xanh của gen gus trên mẫu lây nhiễm (hình 3.14).
•* é « 4 ệị
Hình 3.14. Lựa chọn vector chuyên gen thích hợp vào mâu lả khoai tây AtlanticịAA39: p6d35S- GUS; AA43: pCAMBIA1301)
Bủng 3.14. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyên gen vào đoạn thân cây khoai tây Atlantic thông qua vi khuân A. tume/aciens
CT Vector chu yển gen Tỷ lệ biếu hiện tạm thời
của gen gus (%)
Mức độ biếu hiện gen
gus
Đ/c 0 0 0
1 p6d35S-GUS 76,11 Đậm vừa
2 pCAMBIA 1301 42,22 Hơi đậm
Từ kết quả trên bảng 3.14 cho thấy: Khi biến nạp với vector pCAMBIA1301 thì tỷ lệ biêu
hiện gen gus tạm thời ở mẫu đoạn thân đạt tỷ lệ thấp 42,22%, mức độ biêu hiện màu xanh
chàm nhạt. Trong khi sử dụng vector p6d35S-GƯS đê biên nạp thì cho hiệu quả chu yên gen
gus cao hơn, mức độ biêu hiện tạm thời của gen gus đạt 76,11%, mức độ biếu hiện tương
đối tốt (màu xanh đậm) (hình 3.15).
Hình 3.15. Lựa chọn vector chuyên gen thích hợp vào đoạn thân khoai tây Atlantic (AA39: pCAMBỈAl301; AA43: p6d35S-GUS)
chu yển gen tiếp theo.
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuân (OD600nm) lên tỉ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus
Mật độ vi khuân thê hiện sô tê bào vi khuân trong một đơn vị thê tích và nó ảnh hưởng tới lượng tế bào vi khuân có thế tiếp xúc với mô thực vật do đó sẽ ảnh hưởng tới hiệu quả của quá trình chuyên T-DNA từ vi khuân vào tê bào thực vật. Các mật độ vi khuấn ở OD600 lần lượt là 0; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2 và 1,5 đă được sử dụng trong thí nghiệm. Ket quả
thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.15 Bảng 3.15. Anh hưởng của mật độ vi khuân tới tỷ lệ
biêu hiện tạm thời của gen gus
ở cây khoai tây chuyên gen
CT Mât dô vi khuấn
(OD6 0 0)
Tỷ lệ biêu hiện gen gus tạm thời (%)
Ớ mẫu lá chu yên gen
Ớ mẫu đoạn thân chu yên gen
Đ/C 0 0 0 1 0,5 31,11 33,88 2 0,8 70,55 74,44 3 1,0 42,22 43,88 4 1,5 58,88 62,22 5 2 34,40 35,41
Ket quả trên bảng 3.15 cho thấy: Với các mẫu lá biến nạp, mật độ vi khuấn ảnh
hưởng tới sự biếu hiện tạm thời của gen gus. Ở giá trị OD6 0 0= 0,5 tỷ lệ biểu hiện tạm thời
của gen gus chỉ đạt 31,11 % nhưng khi OD600= 0,8 thì tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus tăng lên 70,55%. Tiêp tục tăng mật độ vi khuân, tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus giảm.
Đối vói mẫu biến nạp là các đoạn thân chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. Cụ thê ở giá trị OD600= 0,5 tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus chỉ đạt 33,88% nhưng khi
OD6Q0= 0,8 thì tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus tăng lên 74,44%. Tiêp tục tăng mật độ vi khuân, tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus giảm.
Ngu yên nhân là do ở mật độ cao có sự cạnh tranh giữa các tế bào vi khuẩn xung quanh mẫu biến nạp làm ảnh hưởng tới hiệu quả của quá trình chu yên T-DNA vào cây khoai tây. ơ OD600 = 0,8 thì tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus đạt giá trị cao nhất, mức
độ biếu hiện đậm vừa, vùng biêu hiện rộng. Ngoài ra, với các mẫu lá và đoạn thân sau khi
được lây nhiễm với Agrobacterium mật độ cao (OD600 >1,0) chúng tôi quan sát thấy hiện tượng vi khuấn sinh trưởng mạnh, lấn át mẫu thực vật, làm mẫu thực vật không có khả năng
phục hồi sau khi biến nạp và việc loại bỏ Agrobacterium gặp nhiều khó khăn. Vì thế, chúng
tôi đă lựa chọn mật độ vi khuấn có OD600 = 0,8 cho các thí nghiệm chu yến gen tiếp theo.
3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus
Acetos yringon (AS) là một hợp chất của phenol được tiết ra tại vùng bị thương của cây.
AS đóng vai trò dẫn dụ vi khuấn Agrobacterium tới mô lây nhiễm và kích hoạt các gen vùng
vir hoạt động để hoạt hóa cơ chế chu yên T-DNA vào tế bào thực
AS được bô sung vào dịch vi khuan 1 - 2h trước khi biến nạp với nồng độ lần lượt là:
0, 100, 200, 300 và 400 JJ.M. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.16 Bảng 3.16.
Anh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ ỉệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở
mâu khoai tây sau khi chuyên gen
CT
Nông độ AS (I^M)
Tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus (%)
ở mâu lá biên nạp ở mâu đoạn thân biên nạp
Đ/c 0 6,67 7,78
1 50 21,66 26,66
2 100 26,11 31,11
3 200 31,66 32,78
4 400 8,33 9,44
Kết quả trên bảng 3.16 cho thấy: AS có ảnh hưởng rõ rệt tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời
có AS, tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở mẫu khoai tây gần như không đáng kê. Biêu hiện tạm thời của gen gus tăng khi tăng nông độ AS tới 200 uM.
Đối với mẫu lá: Tỷ lệ biêu hiện tạm thời đạt cao nhất là 31,66% khi bô sung 200
\ảM as vào dịch vi khuân. Khi bô sung nông độ AS cao (400 P-M) lại làm giảm tỷ lệ biêu
hiện tạm thời của gen gus là 8,33%.
ặf ý 4 * i ề ♦ • *
t ị ị àéik M
l í v f I f f !ỉ
Hình 3.16. Anh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus lên mâu lả khoai tây Tương tự với đoạn thân: Tỷ lệ biếu
hiện tạm thời đạt cao nhất là 32,78%
khi bổ sung 200 |J.M AS vào dịch vi khuẩn. Khi bổ sung nồng độ AS cao (400 |iM)
lại làm giảm tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen gus còn 9,44%.
Như vậy, với kết quả thu được ở nồng độ 200 JJ.M AS bô sung vào dịch vi khuấn từ 1 - 2 giờ trước khi biến nạp được chúng tôi lựa chọn cho chu yến gen vào cây khoai tây.
Hình 3.J7. Anh hưởng của hàm lượng AS lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus ở thân khoai tây
3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lầy nhiễm tới tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen gus ở cây khoai tây Atlantic
Thời gian lây nhiễm ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của quá trình biến nạp. Nếu thời gian lây nhiễm quá ngắn thì sẽ không đảm bảo hiệu quả xâm nhiễm của vi khuân vào mô thực vật. Với mồi đối tượng thực vật sẽ có thời gian lây nhiễm nhất định. Do đó trong thí nghiệm này chúng tôi nghiên cứu thời gian lây nhiễm ở các thời gian khác nhau lần lượt là 20 phút, 40 phút và 60 phút. Ket quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.17
Bảng 3.17. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiêm tới tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus ở mẫu khoai tây sau khi chuyên gen
CT
Thời gian lây nhiễm (phút)
Tỷ lệ biếu hiện tạm thời ở mẫu lá biến nạp (%)
Tỷ lệ biêu hiện tạm thời ở mẫu đoạn thân biến nạp (%)
Đ/c 0 0 0
1 20 52,78 81,67
2 40 78,89 96,11
3 60 55,55 73,89
Ket quả ở bảng 3.17 cho thấy: Tỷ lệ biếu hiện tạm thời của gen gus đối với mẫu lá
biến nạp thấp nhất ở thời gian lây nhiễm là 20 phút ( 52,78%). Tăng thời gian lây nhiễm
làm tăng hiệu quả biến nạp. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt cao nhất ở thời gian
lây nhiễm 40 phút chiếm 78,98%, mức độ biểu hiện màu xanh chàm đậm. Tu y nhiên khi tăng thời gian lây nhiễm lên 60 phút thì lại giảm hiệu quả biến nạp xuống còn 55,55%.
Đối với mẫu biến nạp là đoạn thân: Tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus thu được
cao hơn so với mẫu lá biến nạp cụ thê ở các công thức CT1, CT3 lần lượt có tỷ lệ là
81,67%, 73,89% so với CT2 là 96,11% chứng tỏ ràng tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus
Hình 3.18. Anh hưởng của thời gian lây nhiêm lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen
gus ở đoạn thân khoai tây Ngu yên nhân của hiện tượng này
có thế là do thời gian lây nhiễm cao sẽ
tăng khả năng cạnh tranh giữa các tê bào vi khuân làm ảnh hưởng tới hiệu quả của quá trình biến nạp. Do đó chúng tôi sử dụng thời gian lây nhiễm là 40 phút cho các thí nghiệm chu yển gen tiếp theo trên cây khoai tây Atlantic.
KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Dựa trên các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
a/ Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh:
- Môi trường MS là môi trường khoáng cơ bản cho khả năng tạo callus từ mẫu lá và đoạn thân tốt hơn, tốc độ hình thành callus nhanh hơn, callus có màu trắng, sáng có độ xốp hơn so với callus hình thành trên môi trường N6.
- Môi trường MS có bố sung 0,5-1 mg/1 2,4-D và 0,1 mg/1 IAA cho tỷ lệ tạo callus từ mẫu lá, đoạn thân khoai tây tốt nhất.
- BAP và kinetin có ảnh hưởng tích cực tới khả năng tạo callus từ mẫu lá và đoạn thân khoai tây. Môi trường có bô sung 0,5 mg/1 BAP và 1 mg/1 kinetin cho tỉ lệ tạo callus cao nhất.
- Khả năng tạo callus từ mẫu lá hoặc đoạnthân khoai tây tôt nhất khi bố sung 60 g/1 xaccarozơ vào môi trường nuôi cấy.
- Môi trường có bô sung 400 mg/1 caseinhydrolysate đã có tácdụng làm
tăng khả năng tạo callus từ mẫu lá và đoạn thân khoai tây.
b/ Nghiên cứu chu yển gen: một số yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình