Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi

L ỜI CAM ĐOAN

2.2.1. Các nghiên cứu tạo callus và tái sinh chồi

-Đánh giá ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

-Đánh giá ảnh hưởng của các loại xytokinin tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

-Đánh giá ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau -Đánh giá ảnh hưởng của xaccarozơ tới khả năng taọ callus từ các dạng mô khác nhau

-Đánh giá ảnh hưởng của Casein h ydrolysate (CH) tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau

31

Cây khoai tây in vitro

Cấy mẫu trên môi trường tạo callus (5 mẫu lá/đĩa ;10 mẫu đoạn thân/đĩa) (TN1-TN5)

n Nuôi ở 26 °c, để trong tủ tối ổn nhiệt, JL thời gian 25-30 ngày

Cấy chu yển mẫu callus (5 mẫu lá/đĩa ;10 mẫu đoạn thân/đĩa) sang môi trýờng tái sinh chồi (SM)

Nuôi ở 26 °c, chiếu sáng 8-10h/ ngày, thời gian 8-10 ngày

Chồi đạt chiều cao 1-2 cm được cấy chu yển sang bình nuôi có chứa môi trường NC fl Nuôi ở 26 °c, chiếu sáng 8-10h/ ngày,

Jt thời gian 10-15 ngày Tạo cây tái sinh hoàn chỉnh

2.2.3. Các nghiên cứu chu yển gen

- Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho

chu yển gen vào khoai tây

- Lựa chọn vector chu yển gen thích hợp

-Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD6 0 0 n m) lên tỉ lệ biếu hiện tạm thời của

gen gus

-Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetos yringone (AS) lên tỷ lệ biêu hiện tạm thời

của gen gus

-Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 2 .3. Ph ưo ng p há p ng h iên cứu

2.3.1. Phương pháp thiết kế thí nghiệm

- Phương pháp thí nghiệm: Tối ưu hoá từng yếu tố, mỗi công thức thí nghiệm

hấp khử trùng ở 121°c, 1 atm, trong 30 phút. Sau đó môitrường được chu yển sang 8 đĩa Petri (loại 0 6 cm) hoặc 6 đĩa Petri (loại 0 7,5 cm)

+ Mầu thí nghiệm: lá, đoạn thân

+ Đối với thí nghiệm tái sinh: Mỗi đĩa môi trường loại 0 6 cm cấy 5 mẫu, loại loại 0 7,5 cm cấy 10 mẫu

+ Các thí nghiệm chu yến gen mỗi đĩa môi trường cấy 20 đoạn thân/ 20 mẫu lá / CTTN

- Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. So callus tạo thành được thống kê sau 1 tháng nuôi cấy

- Các đĩa mẫu nuôi cấy được đặt trong tủ ổn nhiệt RUMED với nhiệt độ 26±l°c , chiếu sáng lOh/ngày

- Quan sát và ghi kết quả thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nuôi cấy

- Ket quả thí nghiệm trước sẽ là cơ sở đê tiến hành thí nghiệm tiếp sau

2.3.2. Phương pháp chuân bị mâu thực vật

- Cây in vitro của hai giống khoai tây nghiên cứu được duy trì và nhân giống trên

môi trường NC (phụ lục). Lựa chọn các cây sinh trưởng bình thường, khoe, ở độ tuôi 2-3 tuần làm vật liệu khởi đầu

- Mầu đoạn thân: cắt thân thành các đoạn dài lcm, loại bở đoạn thân phần ngọn và phần gốc

- Các mẫu lá sử dụng trong chuyển gen gồm cả cuống lá

- Các thí nghiệm chu yến gen: Gây tổn thương nhẹ trên lá trước khi lây nhiễm với

Agrobacterium bằng cách dùng dao cấy vạch nhẹ trên bề mặt lá

Sau khi cắt, mẫu được trộn đều trước khi tiến hành các công thức thí nghiệm đê bảo đảm nguồn vật liệu khởi đầu của các công thức là như nhau.

2.3.3 Phương pháp chuân bị dịch vi khuân

Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol ở - 20 °c lên đĩa môi trường LB [51]

thạch có bô sung rifampicin 100 mg/1 và kanamycin 50 mg/1, nuôi ở 21°c trong 2-3 ngày. Sau đó lây một khuân lạc vi khuân nuôi trong môi trường LB lỏng

có bồ sung AS, sau đó trộn đều và nuôi lắc ở 160 vòng/ phút ở 28 °c. Sau 2-4 giờ lấy dịch huyền phù vi khuân đem biến nạp.

2.3.4. Phương pháp chuyên gen

Chuyên gen vào cây khoai tây thông qua vi khuân A. tumefaciens được tiến hành

theo qu y trình của De Block (1988) được mô tả theo sơ đồ sau :

Nuôi cây mâu vi khuân A. tumefaciens:

Cây gạt Agrobacterium trên môi trường LB [51] có bô sung kháng sinh thích họp,

nuôi ở

28°c,

Chuân bị mâu thực vật:

Cắt mẫu trên giấy lọc đặt trong đĩa Petri chứa môi trường MS lỏng

Chuãn bị dịch vi khuân lây nhiêm:

- Lấy khuẩn lạc Agrobacterium từ đĩa LB đặc cấy sang môi trường LB lỏng bổ sung

200 uM AS

- Trộn đều, nuôi lắc 120 vòng/phút, 2-3h - Đo OD6 0 0= 0,5 - 0,8

Lây nhiễm:

Đồng nuôi cấy:

^ Nuôi tối ở 22

°c,

Loại bỏ Agrobacterium:

Cấy chu yên mẫu (20 mẫu/đĩa) sang môi trường LCM + 500 mg /1 cefotaxim

Nếu còn Agrobacterium ở mẫu, rửa mẫu 3 lần bằng môi trường MS bổ sung 500

mg/1 cefotaxim.

Chọn lọc và tái sinh chồi *

Cấy chu yển mẫu (20 mẫu/đĩa) sang mt LCM + 500 mg/1 cefotaxime + KS chọn lọc

2.3.5. Môi trường nuôi cấy

- NC = MS + 60-80 g/1 xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar. - CI = MS + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar

- CSM = MS/2 + 60g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8g/l agar + 0,5 mg/1 BAP + 0,2 mg/1 GA3 + 0,1 mg/1 NA A + 0,1 mg /1 IAA.

^ Nuôi tối ở 22

°c,

Chuyển mẫu callus tạo thành sang mt CSM + KS chọn lọc Nuôi ở điều kiện chiếu sáng cao (30001ux), 10-15 ngày.

- LCM = MS + 30g/l xaccaroza +100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar + 1 mg/1

2.4- D + 500 mg/1 Casein Hydrolysate (CH).

2.3.6.Phương pháp đánh giá biêu hiện gen gus tạm thời Mầu thực vật sau khi đồng

nuôi cấy 3 ngày được nhuộm đế quan sát biêu hiện của gen gus theo phương pháp của

Jefferson và cộng sự (1987). Mầu tế bào thực vật (phôi non, callus, chồi, rễ cây tái sinh, lá,

đoạn thân, lát cắt củ...) đã được chu yên gen gus được nhuộm với dung dịch X- Gluc, ủ mẫu

ở nhiệt độ 37°c, trong thời gian 8- 12 giờ. Tỷ lệ biếu hiện gen gus tạm thời được tính theo

số đốm xanh chàm xuất hiện trên mẫu nhuộm. 2.4. Bố trí thí nghiệm

2.4.1.Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

*Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ

các dạng mô khác nhau.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2 loại nền khoáng MS [39]; N6 [23] theo công thức sau:

CT1 = MS + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar + 1 mg/1

2.4- D + 500 mg/1 Casein Hydrolysate (CH).

CT2 = N6 + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar + 1 mg/1

2.4- D + 500 mg/1 Casein Hydrolysate(CH).

- Các dạng mô nuôi cấy: mô lá, đoạn thân.

- M ỗ i công thức cấy 3 đĩa, 10 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là đoạn thân), 5 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là lá).

- Hàng tuần theo dõi sự hình thành callus (cấy chu yến sau 3-4 tuần nuôi cấy) *Thí

nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của auxin tới khá năng tạo callus Thí nghiệm sử

dụng môi trường CI có bô sung 2,4-D và IAA ở các nông độ khác nhau.

"\2,4D (mg/1) 0 0,5 1 2

0,1 CT5 CT6 CT7 CT8

0,5 CT9 CT10 CT11 CT12

1 CT13 CT14 CT15 CT16

- Loại mẫu cấy: lá non, đoạn thân.

-Mỗi công thức cấy 3 đĩa, 10 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là đoạn thân), 5 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là lá).

-Hàng tuần theo dõi sự hình thành callus (cấy chu yến sau 3-4 tuần nuôi cấy) *Thí

nghiệm 3: Đánh giá anh hưởng của cytokinin tới khả năng tạo callus Thí nghiệm sử

dụng môi trường CI có bô sung BAP và Kinetin, IAA, 2,4 D thích hợp (kết quả từ các TN1 -2) ở các nồng độ khác nhau. BAP (mg/1) K i n e t i n (m g /1 0 0,5 1 2 0 CT1 CT2 CT3 CT4 0,1 CT5 CT6 CT7 CT8 0,5 CT9 CT10 CT11 CT12 1 CT13 CT14 CT15 CT16

- Loại mẫu cấy: lá non, đoạn thân.

-Mồi công thức cấy 3 đĩa, 10 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là đoạn thân), 5 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là lá).

-Hàng tuần theo dõi sự hình thành callus (cấy chu yến sau 3-4 tuần nuôi cấy) *Thí

nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của xaccarozơ tới khá năng taọ

callus

Thí nghiệm sử dụng môi trường CI (không có xaccarozơ) với nồng độ BAP + Kinetin, IAA, 2,4 D thích hợp (kêt quả từ các TN1-3) có bô sung xaccarozơ ở các nồng độ khác nhau.

Xaccarozơ (g/1) 0 20 40 60 80

CTTN CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

-Mỗi công thức cấy 3 đĩa, 10 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là đoạn thân), 5 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là lá).

-Hàng tuần theo dõi sự hình thành callus (cấy chu yên sau 3-4 tuần nuôi cấy) *Thí

nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của casein hydrolysate (CH) tới khả

năng tạo callus

Thí nghiệm sử dụng môi trường CI (không có xaccarozơ) với nồng độ BAP kinetin, IAA, 2,4D, hàm lượng xaccarozơ thích hợp (kết quả từ các TN1- 4) và bô sung casein hydrolysate (CH) với các nồng độ khác nhau: 0; 100; 200; 400; 600 mg/1.

Casein h ydrolysate (CH) mg/1

0 100 200 400 600

CTTN CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

- Loại mẫu cấy: lá non, đoạn thân.

-Mỗi công thức cấy 3 đĩa, 10 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là đoạn thân), 5 mẫu/đĩa (đối với mẫu nuôi cấy là lá).

-Hàng tuần theo dõi sự hình thành callus (cấy chu yển sau 3-4 tuần nuôi cấy)

2.4.2. Nghiên cứu chuyên gen vào khoai tây thông qua Agrobacterium tumefaciens

*Thí nghiệm 6: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyến gen vào khoai

tây

CTTN CT1 CT4 CT5 CT6

Chủng VK Đối chứng C58 EHA105 AGL-1

Sử dụng các chủng C58, EHA105, AGL-1 mang vector pCAMBIAl301 có mật độ vi khuẩn OD<300 = 0,8-1,0 Mầu thí nghiệm : lá, đoạn thân 20 đoạn thân/ 20 mẫu lá / CTTN

Nhuộm gus sau 3 ngày đồng nuôi cấy Quan sát, ghi kết quả,

chụp ảnh các CTTN.

CTTN CT1 CT2 CT3

Chủng VK Đối chứng AA43 AA39

- Sử dụng các chủng AA43: pCAMBIA1301; AA39: p6d35S-GUS có

OD(500

= 0,8-1,0

Mầu thí nghiệm : lá , đoạn thân 20 đoạn thân/ 20 mẫu lá / CTTN

Nhuộm gus sau 3 ngày đồng nuôi

cấy.

Quan sát, ghi kết quả, chụp ảnh các CTTN.

*Thí nghiệm 8: Đánh giá ánh hưởng của mật độ vi khuẩn (ODồoo) lên ti lệ biêu hiện

CTTN CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6

OD₆00 Đối chứng 0,5 0,8 1,0 1,5 2,0

Sử dụng chủng Agrobacterium (kết quả của TN 6, 7) làm vật liệu chu yển gen. Mau thí nghiệm : lá , đoạn thân 20 đoạn thân/

20 mẫu lá / CTTN Nhuộm gus sau 3 ngày

đồng nuôi cấy Quan sát, ghi kết quả, chụp ảnh các CTTN.

*Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ

biêu hiện tạm thời của gen gus

CTTN CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

AS (uM) 0 50 100 200 400

Sử dụng chủng Agrobcicterỉum (kết quả của TN 6, 7 và 8) Mầu thí nghiệm: lá , đoạn thân 20 đoạn thân/

20 mẫu lá / CTTN.

Môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy có bo sung AS với các nồng độ khác nhau (CT1-CT5)

Quan sát, ghi kết quả, chụp ảnh các CTTN. 2.5. Các chỉ tiêu đánh giá

+ Tỷ lệ tạo callus: số cụm callus tạo thành từ một mẫu nuôi cấy/ tông số mẫu cay X 100(%)

+ Tỷ lệ tạo chồi: số chồi tái sinh từ callus/tông số mẫu callus X 100(%)

+ Tỷ lệ biêu hiện tạm thời của gen gus (TEE)

TES

TEE (%) = ££—- X 100 (%)

TDS

Trong đó : TEE (transient expression efficiency) - Tỷ lệ biêu hiện tạm thời

TES (Total of Expression Samples) - Tông so mẫu có biếu hiện gus TDS

(Total of Dying Samples) - Tong so mẫu nhuộm X-Gluc 2.6. Xử lý số liệu

Số liệu thu được được thống kê và xử lý bằng phần mem Microsolf Excel.

2.7. Thiết bị nghiên cứu

Tủ cấy vô trùng, tủ nuôi lắc điều khiển nhiệt độ RUMED, tủ nuôi có chiếu sáng INOVA, máy ly tâm, nồi hấp khử trùng....

2.8. Địa điểm và thòi gian nghiên cứu

- Đe tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điêm công nghệ tế bào thực vật, Viện Di Tru yền Nông Nghiệp.

Chương 3

KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN

Theo Yee Shirley và cộng sự (2001), các chồi khoai tây có thể được tái sinh từ một mảnh cuống có kèm cả một phần mô lá hoặc một đoạn thân. Vì vậy, trong nghiên cứu này, mẫu mô lá và đoạn thân của giống khoai tây Atlantic đã được sử dụng làm nguồn vật liệu khởi đầu [12].

3.1.1. Anh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ các dạng mô khác nhau ở cây khoai tây

Thành phần khoáng và các chất ĐHST đóng vai trò rất quan trọng trong môi trường tạo callus ở các mẫu mô thực vật. Do đó, 2 loại nền khoáng MS [40]; N6

[24] đă được chúng tôi sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của nền khoáng tới khả năng tạo callus ở khoai tây theo công thức:

CT1 = MS + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar + 1 mg/1

2.4- D + 500 mg/1 Casein Hyđrolysate(CH).

CT2 = N6 + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar + 1 mg/1

2.4- D + 500 mg/1 Casein Hyđrolysate(CH).

Sau 1 tháng nuôi cấy, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1 và 3.2.

Bảng 3.1. Anh hưởng của các nền khoáng tới khả năng tạo callus từ mô lả cây

khociỉ tây. Môi trường Số mẫu lá nuôi cấy Số mẫu lá có callus Tỉ lệ tạo callus (%) Hình thái callus CT1 45 33 73,3%

Nhỏ, xuất hiện ở đầu vết cắt và xung quanh phiến lá, mầu trắng sáng và xốp

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Callus xuất hiện chủ yếu ở đầu vết cắt và xung quanh phiến lá. ơ công thức 1 tỷ lệ sống của mẫu cấy đạt rất cao và đạt 73,3% trong khi đó ở công thức 2 cho tỷ lệ tạo callus là 53,3%- Môi trường MS tỏ ra có tác dụng kích thích rất mạnh đến khả năng phát sinh hình thái tạo callus của mẫu cấv, tốc độ hình thành callus nhanh hơn, khối callus to hơn và hình thái có mầu trắng, sáng có độ xốp hơn so với callus hình thành trên môi trường N6 (Hình 3.1).

Hình 3.1. Anh hưởng của các nên khoảng tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây (1 .Môi trường: N6; 2. Môi trường: MS)

Bảng 3.2. Anh hưởng của các nên khoảng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân cây khoai tây

Môi trường

Số mẫu đoạn thân nuôi cấy Số mẫu đoạn thân có callus Tỉ lệ tạo callus (%) Hình thái callus CT1 90 78 86,6%

Nhỏ, xuất hiện ở hai đầu vết cắt, mầu trắng sáng và xốp.

CT2 90 66 73,3%

Nhở, xuất hiện ở hai đầu vết cắt, mầu trắng sáng và xốp.

Ket quả ở bảng 3.2 cho thấy: Callus xuất hiện chủ yếu ở hai đầu vết cắt của đoạn

thân. Tỷ lệ sống của mẫu cấy đạt rất cao trên cả hai công thức môi trường. Tu y nhiên ở môi trường MS tốc độ hình thành callus nhanh hơn, khối callus to hơn và hình thái có mầu trắng, sáng có độ xốp hơn so với callus hình thành trên môi trường N6.

Ket quả nghiên cứu trên mẫu lá và đoạn thân đều cho thấy môi trường MS tỏ ra ưu thế hơn môi trường N6 (Hình 3.2). Môi trường khoáng LCM = MS + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/1 myoinositol + 8 g/1 agar + 1 mg/1 2,4D + 500 mg/1 CH được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.2. Anh hưởng của các nền khoảng tới khả năng tạo callus từ đoạn thân khoai tây (3. Môi trường: N6; 4. Môi trường: MS)

3.1.2. Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus ở khoai tây

IAA và 2,4-D là các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin có vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình tạo rễ.

Thí nghiệm sử dụng môi trường CI có bô sung IAA và 2,4-D với các hàm lượng khác nhau nhằm xác định môi trường tạo callus phù hợp cho cây khoai tây.

Bảng 3.3. Anh hưởng của auxin tới khả năng tạo callus từ mô lá cây khoai tây. Môi trường 2,4D (mg/1) IAA (mg/1) Số mẫu lá nuôi cấy Số mẫu lá có callus Tỉ lệ tạo callus Hình thái callus

CT1 0 0 45 0 0 _{Không xuất hiện}

CT2 0,5 0 45 18 40,0 Mầu nâu vàng và cứng CT3 1 0 45 34 75,5 Nhỏ, mầu trắng và xốp CT4 2 0 45 30 66,6 _{Nhỏ, mầu trắng}