2.2. Sơ ựồ khối nội dung nghiên cứu chắnh của luận án
Hình 2.1 Sơ ựồ nội dung nghiên cứu 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu ựặc ựiểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 2.3.1.1. đặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Ớ Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh
Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh ựược thực hiện dựa theo phương pháp của Whitman (2004) [205]. Mẫu bệnh phẩm thu từ gan, thận và phần cơ tại vết loét của cá mú bệnh ựược cấy trên môi trường Trypticase Soya Agar (TSA; Difco), Trypticase Soya Broth (TSB; Difco) có bổ sung 2 % NaCl và môi trường chọn lọc vi khuẩn Vibrio là Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose Agar (TCBS Agar; Merck). Các chủng thuần sau khi phân lập ựược giữ trong môi trường TSB có bổ sung 20 % glycerol (Merck) ở -70 oC, hoặc ựông khô ựể lưu giống phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu ựáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton,1822) nuôi tại Khánh Hòa ựối với vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus đặc ựiểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú E. coioides đặc ựiểm phân tử kháng thể IgM của cá mú E. coioides đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu của cá mú E. coioides ựối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu của cá mú E. coioides với V. parahaemolyticus và ảnh hưởng của β-glucan ựến ựáp ứng miễn dịch này. KẾT LUẬN
ỚNuôi thu sinh khối
Vi khuẩn ựược nuôi thu sinh khối ở bình thủy tinh 50 mL chứa môi trường TSB có 2 % NaCl, ủở 33 oC trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.
Ớ Xác ựịnh các ựặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và ựịnh danh vi khuẩn
Hình thái vi khuẩn ựược xác ựịnh bằng cách quan sát tế bào vi khuẩn ở các tiêu bản ép, nhuộm Gram (Difco) dưới kắnh hiển vi (CX31J, Olympus) ở ựộ phóng ựại 1000 lần sử dụng vật kắnh dầu (100 X).
Khả năng dung huyết của vi khuẩn ựược khảo sát theo phương pháp của Twedt et al. (1970) [202], trên môi trường thạch máu (Blood agar base Ờ BA, Difco) bổ sung 2 % NaCl và 5 % máu thỏ.
Các ựặc ựiểm sinh hóa ựược xác ựịnh dựa trên các bộ kắt API-20E và Biolog GN system (BioMerieux) với các bước thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, một số phản ứng sinh hóa khác cũng ựược làm thêm như: Oxidase, Catalase, O/F, O/129 (150 ộg) và xác ựịnh ựặc ựiểm sinh thái thông qua khả năng chịu ựựng ựộ mặn của vi khuẩn ở các nồng ựộ muối: 0, 3, 6, 8 và 10 %. Các phản ứng này thực hiện theo phương pháp của Whitman (2004) [205].
định danh vi khuẩn ựược thực hiện kết hợp 2 phương pháp: định danh theo phương pháp vi sinh vật học truyền thống dựa trên các ựặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa thu ựược và tra theo khóa phân loại của Bergey [90]. để kiểm chứng kết quả ựịnh danh theo phương pháp truyền thống, chủng V3 ựược ựịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tắch trình tựựoạn gen 16S rDNA theo phương pháp của Harris và Hartley (2003) [84] (Kết quả trình bày ở phụ lục 2).
2.3.1.2. Phân tắch thành phần protein của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus
Thành phần protein của 4 chủng V. parahaemolyticus ựược xác ựịnh bằng kỹ thuật Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) theo phương pháp của Tsang et al. (1983) [201]. Các bước tiến hành như sau:
Sau khi nuôi sinh khối, huyền dịch vi khuẩn ựược ly tâm 6.000 vòng/phút ở 4
oC trong 10 phút. Rửa và ly tâm 3 lần trong dung dịch Photphate Buffered Saline (PBS) ựể thu phần vi khuẩn kết lắng ở ựáy ống nghiệm. Xác ựịnh khối lượng vi
khuẩn thu ựược bằng cân phân tắch (AV-320, Shimadzu, Nhật). Pha loãng vi khuẩn trong dung dịch ựệm (950 ộl LaemmLi sample buffer, 50 ộl dung dịch 2- Mecaptoethanol, Bio-rad) ựểựạt nồng ựộ 1 ộg vi khuẩn/ộl.
Mẫu vi khuẩn ựược sốc nhiệt ở 95 oC/5 phút trước khi cho 5 ộg (5 ộl) mẫu vào các giếng trên bản thạch Polyacrylamide và thực hiện ựiện di ở 200 V trong 45 phút sử dụng buồng ựiện di Mini-Protein tetra cell (Bio-Rad).
Nhuộm bản thạch bằng Silver stain kit (Bio-rad) với các bước thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Khối lượng phân tử các protein của vi khuẩn trên bản thạch ựược tắnh toán trên cơ sở so sánh với mẫu hỗn hợp protein chuẩn (Cat. 161- 0314, Bio-rad).
2.3.1.3. Xác ựịnh khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus ở cá mú chấm cam
a. Chuẩn bị vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu (V1, V2, V3 và A) lưu giữở -70 oC ựược nuôi cấy tăng sinh trong môi trường TSB bổ sung 2 % NaCl ở 33 oC trong 18 - 24 giờ.
Dựa vào ựường cong sinh trưởng tương ứng của mỗi chủng vi khuẩn ựã ựược xác ựịnh trước ựể xác ựịnh thời ựiểm thu hoạch (Phụ lục 3). Huyền dịch vi khuẩn ựược ly tâm 6.000 vòng/phút ở 4 oC trong 10 phút (H-1300-Kokusan, Nhật) rồi pha loãng trong PBS. Xác ựịnh mật ựộ vi khuẩn thông qua ựường chuẩn ựược thiết lập trước dựa trên sự tương quan giữa mật ựộ quang OD ( đo bằng máy ựo quang phổ Smartspec TM3000, Biorad ở bước sóng 600 nm) và mật ựộ vi khuẩn sống (cfu/mL) (Qua nuôi cấy xác ựịnh gián tiếp trên TCBS) theo phương pháp của Dalgaard et al. (1994) [54] và Begot et al. (1996) [29] (Phụ lục 3). Pha loãng huyền dịch khuẩn trong PBS ựể ựạt mật ựộ cần thắ nghiệm ựộc lực tương ứng là 102, 103, 104 và 105 cfu/g cá.
b. Cá mú chấm cam và ựiều kiện thắ nghiệm
Cá mú khỏe dùng cho thắ nghiệm cảm nhiễm các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V1, V2, V3 và A có khối lượng thân trung bình lần lượt là 38,43 ổ 3,07; 32,63 ổ 1,83; 17,57 ổ 1,40; 25,80 ổ 2,33 g/con ựược phân bố ngẫu nhiên vào các bể composit 300 lắt chứa nước biển có ựộ mặn 33 Ẹ, nhiệt ựộ 27 - 28 oC, sục khắ và bơm lọc tuần hoàn liên tục, mỗi bể chứa 6 con.
c. Bố trắ thắ nghiệm và cách gây nhiễm
Mỗi chủng vi khuẩn ựược bố trắ cảm nhiễm với 4 mật ựộ vi khuẩn 102, 103, 104 và 105 cfu/g cá và nhóm ựối chứng. Huyền dịch vi khuẩn với các mật ựộ khác nhau ựược tiêm vào cơ của cá thắ nghiệm và tiêm 0,2 mL PBS tiệt trùng ựối với nhóm cá ựối chứng. Thắ nghiệm lặp lại 2 lần.
d. Theo dõi chăm sóc, thu mẫu và ựánh giá ựộc lực
Hàng ngày, cá ựược cho ăn bằng thức ăn viên (M503, Uni-president Việt Nam) với khẩu phần 2 % và theo dõi quá trình phát bệnh. Ghi chép dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ chết ở mỗi nghiệm thức thắ nghiệm. Thu cá vừa mới chết hoặc sắp chết ựể phân lập lại vi khuẩn ở gan, thận, vết loét và ựối chiếu với vi khuẩn tiêm vào.
độc lực của mỗi chủng vi khuẩn ựược ựánh giá qua liều gây chết 50 % (Lethal dose - LD50) ựược tắnh theo phương pháp của Reed và Muench (1938) [164] bằng công thức: Trong ựó: a: Tỷ lệ chết tắch lũy cao nhất dưới 50 % b: Tỷ lệ chết tắch lũy thấp nhất trên 50 % A: Nồng ựộ vi khuẩn gây tỷ lệ chết tắch lũy a X: Hệ số pha loãng (Bậc 10)
2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của β-glucan ựến ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu ở cá mú chấm cam
2.3.2.1. Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược bố trắ 4 nghiệm thức ứng với các nồng ựộβ-glucan như sau: ỚNghiệm thức 1: Thức ăn không bổ sung β-glucan (đC)
ỚNghiệm thức 2: Thức ăn bổ sung β-glucan, nồng ựộ 500 ppm (G500) ỚNghiệm thức 3: Thức ăn bổ sung β-glucan, nồng ựộ 1.000 ppm (G1000) ỚNghiệm thức 4: Thức ăn bổ sung β-glucan, nồng ựộ 2.000 ppm (G2000) Thắ nghiệm lặp lại 2 lần
50 - a LgLD50 = [ LgA + (
2.3.2.2. Chuẩn bị thức ăn có bổ sung β-glucan
Thức ăn viên (M503, Uni-president Việt Nam) ựược dùng cho thắ nghiệm này. Trước mỗi bữa ăn, β-glucan (Macrogardệ- Biorigin, Na Uy) ựược trộn vào thức ăn với nồng ựộ tương ứng với các nghiệm thức thắ nghiệm, sau ựó bao các viên thức ăn có β-glucan bằng dầu mực.
2.3.2.3. Cá và ựiều kiện nuôi dưỡng trong thắ nghiệm
Cá mú chấm cam E. coioides sau khi thuần dưỡng 2 tháng, 240 cá thể khỏe mạnh có khối lượng và chiều dài thân trung bình lần lượt là 186,8 ổ 3,9 g và 22,5 ổ 0,2 cm ựược chọn sử dụng cho thắ nghiệm. Cá ựược chia ựều vào 8 bể composite với thể tắch 500 lắt/bể chứa nước biển ựã qua lọc cơ học và xử lý bằng tia UV. Thắ nghiệm trong ựiều kiện nuôi nước chảy vận tốc 2 lắt/phút, sục khắ liên tục, nhiệt ựộ dao ựộng từ 28 - 29 oC, ựộ mặn từ 33 - 34 Ẹ. Mật ựộ thắ nghiệm 30 con/bể.
Cá thắ nghiệm ựược cho ăn mỗi ngày một lần với khẩu phần là 2 % khối lượng thân. Thức ăn có trộn β-glucan chỉ sử dụng cho cá thắ nghiệm trong thời gian 2 tuần ựầu, sau ựó cá tiếp tục ựược cho ăn bằng thức ăn viên bình thường.
Hình 2.2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thắ nghiệm (b) 2.3.2.4. Thu mẫu cá và xử lý mẫu
Ở ngày thứ 1 và ngày thứ 15 kể từ khi chấm dứt dùng loại thức ăn có trộn β- glucan, 3 con cá ở mỗi bể thắ nghiệm (6 con/nghiệm thức) ựược thu ngẫu nhiên ựể phân tắch các thông số miễn dịch.
b. a.
Ở mỗi con cá, mẫu máu ựược thu từ tĩnh mạch cuống ựuôi, phết một lớp mỏng trên 3 lam kắnh sạch ựã tiệt trùng, ựể khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng và sử dụng cho việc xác ựịnh công thức bạch cầu máu.
đồng thời, các mẫu cá ựược giải phẫu, thu tiền thận ựể phân lập tế bào bạch cầu sử dụng cho khảo sát các thông số miễn dịch không ựặc hiệu.
2.3.2.5. Xác ựịnh công thức bạch cầu trong máu
Các mẫu máu sau khi phết mỏng trên lam, ựể khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng. Các lam tiêu bản ựược nhuộm bằng bộ kit Diff Quick (Lucerna Chem) với các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quan sát lam tiêu bản bằng kắnh hiển vi (OLYMPUS CX31) với ựộ phóng ựại 1000X sử dụng vật kắnh dầu. Mỗi lam tiêu bản, ựếm các loại tế bào bạch cầu trên 15 thị trường kắnh dịch chuyển theo ựường zic zac theo phương pháp của Selvaraj et al. (2006) [177].
Phân loại bạch cầu máu cá theo chỉ dẫn của Ainsworth (1992) [18]. Tỷ lệ bạch cầu tổng số ựược tắnh bằng tỷ lệ giữa tổng số các loại bạch cầu ựếm ựược so với tổng số tế bào máu ựếm ựược trên 15 thị trường kắnh (> 100 tế bào). Tỷ lệ mỗi loại bạch cầu ựược tắnh bằng tỷ lệ giữa số bạch cầu mỗi loại ựếm ựược so với tổng số bạch cầu ựếm ựược.
2.3.2.6. Phân lập, nuôi cấy và khảo sát hoạt tắnh thực bào và hoạt tắnh hô hấp của bạch cầu tiền thận
a) Phân lập bạch cầu
Tế bào bạch cầu từ mô thận cá mú thắ nghiệm ựược phân lập dựa theo phương pháp tách tế bào trên phân lớp gradient percoll của Yeh et al. (2008) [212]. Các bước thực hiện ựược tóm lược như sau:
Mẫu mô thận ựược nghiền qua màng lọc 100 ộm trong L-15 (LeibovitỖs Lonza). Cho 2 mL dịch tế bào lên lớp trên của ống gradient percoll (Sigma) tỷ trọng 1,045/1,064 g/cm3, ly tâm ở 1.310 vòng/phút ở 4 oC trong 30 phút (1236R, Scanspeed, Denmark). Thu tế bào bạch cầu tập trung ở xung quanh vạch phân cách giữa 2 lớp percoll.
Kiểm tra chất lượng tế bào phân lập bằng cách ly tâm chuyển tế bào lên lam tiêu bản với tốc ựộ 1000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt ựộ phòng trên máy ly tâm tế bào (Cytospin Thermoscientic, Anh) và quan sát lam tiêu bản trên kắnh hiển vi với ựộ phóng ựại 1000 lần. đếm số lượng tế bào bạch cầu bằng buồng ựếm hồng cầu (Neubauer- Hirschmann). Nuôi cấy tế bào sử dụng cho khảo sát chỉ số thực bào.
Hình 2.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu (a. Ống gradient percoll; b. Dụng cụ làm tiêu bản; c. Máy ly tâm tế bào; d. Tế bào bạch cầu trên lam tiêu bản sau khi nhuộm Diff-quick)
b. Khảo sát hoạt tắnh thực bào của bạch cầu (Phagocytic activity assay- PA)
Hoạt tắnh thực bào của tế bào BC mô thận cá mú ựược xác ựịnh dựa trên thắ nghiệm khảo sát khả năng bắt nuốt các hạt nhuộm huỳnh quang (Hạt bead - Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres, 1ộm) theo phương pháp của Yeh et al.
(2008) [212].
Tế bào BC phân lập từ tiền thận ựược nuôi cấy qua ựêm ở 30 oC trong môi trường L-15. Rửa và thu những tế bào bạch cầu còn sống. định lượng tế bào bằng buồng ựếm hồng cầu và pha loãng trong môi trường L-15 ựể ựạt mật ựộ 1 x 107 tế bào/mL.
d. c.
b.
Cho 500 ộl mẫu BC pha loãng vào các giếng của ựĩa 24 giếng (Nunc) chứa lamen tròn ựã tiệt trùng, ủở 30 oC trong 2 giờ. Hút bỏ hết phần dịch nổi chứa các tế bào chưa bám. Tiếp tục, cho 5ừ107 hạt bead vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ ở 30 oC trong tối ựể các tế bào tiến hành thực bào. Cố ựịnh tế bào bằng methanol (Merck) trong 5 phút và nhuộm các lamen tiêu bản bằng dung dịch Diff Quick (Lucerna Chem). Gắn lamen tròn lên các lam kắnh bằng keo dán (Mount Quick, Electron Microscopy Sciences). Quan sát dưới kắnh hiển vi huỳnh quang (Olympus BX41, Nhật) ởựộ phóng ựại 1000 lần.
Chỉ số thực bào (PA %) của BC xác ựịnh bằng tỷ số giữa tổng tế bào BC tham gia thực bào trên 100 tế bào quan sát, ựồng thời phân loại cường ựộ thực bào (số tế bào bắt ựược 1 hạt, 2 hạt hoặc ≥ 3 hạt) trên tổng số tế bào quan sát.
Hình 2.4: Các bước khảo sát hoạt tắnh thực bào (a: Ống gradient percoll; b: Nuôi cấy tế bào và cảm nhiễm hạt bead; c: Nhuộm tiêu bản; d: Hiện tượng thực bào của bạch cầu)
c. Khảo sát hoạt tắnh bùng nổ hô hấp của bạch cầu (Respiratory burst assay-RBA)
Hoạt tắnh bùng nổ hô hấp (Respiratory burst - RB) của tế bào BC tiền thận ựược xác ựịnh theo phương pháp của Cheng et al. (2007) [38] với các bước thực hiện như sau:
a. b.
d.
Cho 100 ộl tế bào BC (1 x 106 tế bào/mL) vào các giếng (đĩa 96 giếng, Nunc MaxiSorpTM), ủ trong 2 giờ ở 30 oC. Tiếp theo, tế bào lần lượt ựược ủ với 100 ộl dung dịch Zymosan (Sigma) và 100 ộl NBT 0,3 % (Nitroblue tetrazolium, Sigma) trong 30 phút ở nhiệt ựộ phòng. Ngừng phản ứng bằng 100 ộl methanol. Cho tiếp vào mỗi giếng 120 ộl dung dịch KOH 2M và 140 ộl DMSO (dimethyl sulphoxide, Sigma) ựể tạo phản ứng màu.
Hoạt tắnh RB của tế bào BC thể hiện qua mức ựộ màu tạo thành từ phản ứng khử Nitroblue tetrazolium ựược xác ựịnh trên máy ựo quang phổ (iMarkTM, Bio-rad) ở bước sóng 630 nm. Mỗi mẫu thực hiện lặp lại 3 lần trên cùng một ựĩa trong cùng ựiều kiện.
2.3.2.7. Khảo sát khả năng kháng bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus của cá
mú chấm cam sau khi ăn β-glucan.
để xác ựịnh khả năng kháng bệnh ựối với vi khuẩn, cá thắ nghiệm ựược gây nhiễm thực nghiệm ở 2 thời ựiểm: Ngày thứ 1 và ngày thứ 15 sau khi ngừng cho ăn β-glucan.
Ở mỗi thời ựiểm, 12 con cá/bể thắ nghiệm ựược chọn ngẫu nhiên ựể công cường ựộc bằng huyền dịch vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 mật ựộ 1,07 x 105 cfu/g cá. Theo dõi ghi nhận các triệu chứng phát bệnh và số cá chết sau khi gây nhiễm.
2.3.3. Nghiên cứu ựặc ựiểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam 2.3.3.1. Thu huyết thanh
Thu huyết thanh cá mú chấm cam theo phương pháp của Aakre et al (1994) [16]. Các bước thực hiện gồm: Lấy máu tại tĩnh mạch cuống ựuôi của cá mú khỏe,