Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vaccine cho cá vẫn còn khá mới mẽ. Vài công trình nghiên cứu miễn dịch trên cá chỉ mới bắt ựầu thực hiện trong những năm gần ựây, chủ yếu tập trung trên các ựối tượng cá nước ngọt như cá trắm cỏ, cá traẦ
Vũ Dũng Tiến (2005) nghiên cứu đƯMD ở cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus) ựối với vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ựốm ựỏ (Aeromonas hydrophila). Kết
quả nghiên cứu ựã chỉ ra rằng hàm lượng protein trong huyết thanh cá trắm cỏ khác nhau tùy thuộc kắch cỡ, ựiều kiện nuôi cũng như tình trạng sinh lý cá. Ngoài ra, phân tử kháng thể IgM của cá trắm cỏ có khối lượng phân tử khoảng 830 kDa với chuỗi nặng khoảng 77,3 kDa và chuỗi nhẹ khoảng 26,6 kDa [12]. Nghiên cứu của Bui Ngoc Thanh et al. (2009) ựã chứng minh tỷ lệ cá rô phi nhiễm ấu trùng metacercariae của sán lá ký sinh Haplorchis pumilio khi thắ nghiệm cảm nhiễm qua môi trường nước (>70 %), cao hơn nhiều so với phương pháp tiêm xoang bụng (<15 %). Ngược lại, hàm lượng kháng thểở nhóm gây miễn dịch bằng cách tiêm ấu trùng cercariae tăng lên ựáng kể so với nhóm cảm nhiễm qua môi trường nước nuôi [197].
Gần ựây, liên quan ựến bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra Pangasianodon hypophthalmusởựồng bằng sông Cửu Long, hàng loạt các công trình tập trung nghiên cứu ựặc ựiểm của vi khuẩn gây bệnh và bước ựầu nghiên cứu chế tạo vaccine phòng bệnh.
Vũ Thị Thanh Hương và ctv (2011) thông báo ựã tạo ựược chủng vi khuẩn E. ictaluri nhược ựộc thành công bằng phương pháp sử dụng kháng sinh Rifampicin gây ựột biến. Qua ựó, chủng vi khuẩn ựột biến chỉ gây chết cá khỏe 58,9 % trong khi chủng hoang dại gây chết ựến 97 % ở thắ nghiệm công cường ựộc với 105 cfu/con cá [6]. Trong khi ựó, chủng E. ictaluri ựột biến gen purA (PAM) không gây chết cá khỏe với liều tương tự [7]. Mặt khác, hai loại protein ngoại mạc của vi khuẩn này là OmpA và OmpN ựược chứng minh là có khả năng gây kắch thắch miễn dịch ở cá và khuyến nghị sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất vaccine tiểu phần phòng bệnh gan thận mủở cá tra [1].
Ngoài ra, trong khuôn khổ chương trình công nghệ sinh học thủy sản của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ựề tài ỘNghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh ựốm trắng trên cá tra P. hypophthalmus Ợ do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II ( Viện II) chủ trì ựã cho kết quả nghiên cứu bước ựầu ở phòng thắ nghiệm rất khả quan. Cá tra ựược tiêm vaccine kết hợp tá chất Aluminum và tiêm nhắc lại sau 14 ngày ựã tạo lượng kháng thể trong máu cao và kéo dài thời gian bảo hộ cho ựàn cá ựến 2 tháng. Tiếp ựó là ựề tài ỘNâng cao hiệu quả sử dụng vaccine bất hoạt thông
qua sốc nhiệt protein trong vaccineỢ cũng do Viện II thực hiện trong 3 năm (2010- 2012). Kết quả bước ựầu thông báo ựã phân lập ựược 7 chủng vi khuẩn E. ictaluri
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở các tỉnh ựồng bằng sông Cửu Long. Trong ựó, kết quả xác ựịnh ựược 2 chủng có ựộc lực cao trong gây nhiễm thực nghiệm, ựồng thời khi xử lý bằng sốc nhiệt ở 41oC trong 30 phút, các chủng này ựã tạo hàm lượng kháng thể cao nhất ở cá tra [http://www.vienthuysan2.org.vn].
Cũng trên ựối tượng này, nghiên cứu vaccine phòng bệnh do vi khuẩn E. ictaluri ựã thu hút sự quan tâm của công ty Pharmaq, một trong những công ty hàng ựầu trong sản xuất vaccine cho các ựối tượng thủy sản tại Na Uy. Qua nhiều năm nghiên cứu, vaccine Alphaject Panga-1 phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra ựã ra ựời và thử nghiệm thành công trên cá tra tại 3 tỉnh đồng Tháp, An Giang và Bến Tre. Kết quả thử nghiệm ựã chứng minh vaccine này là an toàn cho cá, giúp cá tạo kháng thể ựặc hiệu chống lại vi khuẩn với hệ số bảo hộ từ 50 Ờ 64,7 % [3]. Mới ựây, vaccine này cũng ựã ựược Cục thú y (Thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) cấp phép lưu hành kể từ tháng 4/2013 [http://www.fistenet.gov.vn/e-nuoi- trong-thuy-san/b-nuoi-thuy-san/vac-xin-cho-ca-lan-dau-tien-duoc-chap-thuan-tai- viet-nam/]. Thành công này ựã ựem lại một công cụ hỗ trợ hữu hiệu cho sự phát triển của nghành công nghiệp cá tra tại Việt Nam.
Nhìn chung, gần ựây những nghiên cứu miễn dịch cá và vaccine phòng bệnh cho cá ở Việt Nam ựã ựược quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu còn rất hạn chế, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch trên các ựối tượng cá biển có giá trị kinh tế như cá mú vẫn chưa ựược thực hiện. Một vài công trình nghiên cứu có liên quan ựến miễn dịch và vaccine trên cá nước ngọt và nước lợ ựược Nhà nước ựầu tưựã và ựang thực hiện, kết quả ựạt ựược cho ựến nay mới chỉ ở qui mô phòng thắ nghiệm và chưa ựược áp dụng rộng rãi hoặc chưa ựược công bố. Với những kết quả bước ựầu ựạt ựược, hy vọng các nghiên cứu về miễn dịch và vaccine trên những ựối tượng nuôi có giá trị kinh tế sẽ ựược tiếp tục ựầu tư ựúng mức, nhằm tạo ra những sản phẩm vaccine nội ựịa phù hợp với ựối tượng nuôi,
nâng cao chất lượng sản phẩm và ựủ sức cạnh tranh với thị trường xuất khẩu thủy sản trên thế giới.
Trên thế giới, các loài cá nuôi phổ biến như cá hồi đại Tây Dương, cá hồi vân, cá chẽm, cá tráp, cá nheo, cá tuyết, cá chép, cá rô phiẦựã ựược nghiên cứu rất sâu về đƯMD và ựã có các sản phẩm vaccine thương mại phòng bệnh do virus và vi khuẩn cho các ựối tượng này từ rất sớm [186]. Trong khi ựó, cá mú chấm cam là ựối tượng cá biển có giá trị kinh tế, ựang ựược nuôi rất phổ biến tại Việt Nam và các nước trong khu vực. Song, cá mú chấm cam vẫn chưa ựược sự quan tâm ựúng mức từ phắa các nhà khoa học, từ những nghiên cứu cơ bản về ựặc ựiểm hệ miễn dịch cũng nhưđƯMD ựối với các TNGB. Số lượng công trình nghiên cứu liên quan ựến miễn dịch trên cá mú nói chung và cá mú chấm cam nói riêng trên thế giới vẫn còn rất hạn chế. Vài công trình nghiên cứu trên cá mú ựã bước ựầu phát hiện thời ựiểm hoàn thiện các cơ quan lympho [129], ựặc ựiểm phân tử kháng thể IgM [40], hay ựạt ựược một số kết quả nhất ựịnh trong thử nghiệm vaccine virus bất hoạt phòng bệnh VNN [106], [107], [154], hoặc ứng dụng các chất kắch thắch miễn dịch không ựặc hiệu phòng bệnh do vi khuẩn V. alginolyticus, Streptococcus sp. [38], [39], [212]. Mặc dù các kết quả này có ý nghĩa khoa học quan trọng nhưng phạm vi ứng dụng vẫn còn hạn chế trong qui mô phòng thắ nghiệm. Vì vậy, cho ựến nay, vaccine cho cá mú vẫn chưa có mặt trên thị trường.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về miễn dịch học trên cá còn khá mới mẽ, ựặc biệt là miễn dịch học ở cá biển vẫn còn bỏ ngỏ, trong ựó có cá mú. Trong khi ựó, dưới tác ựộng của biến ựổi khắ hậu kết hợp với nguồn con giống không kiểm soát, dịch bệnh trên cá mú vẫn ựang liên tục xảy ra và ngày càng có chiều hướng nguy hiểm hơn với tác hại to lớn hơn [5], [8], [14]. đây cũng là trở ngại lớn khi ựịnh hướng phát triển nuôi ựối tượng này ở qui mô công nghiệp. Do ựó, các nghiên cứu về TNGB, cơ chế đƯMD ở cá, làm cơ sở cho ứng dụng nghiên cứu vaccine phòng bệnh cho cá mú là rất cần thiết, góp phần thúc ựẩy nghề nuôi cá mú phát triển ở qui mô công nghiệp, năng suất ổn ựịnh và bền vững.
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. đối tượng
Cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton, 1822).
2.1.2. Vật liệu
Bao gồm một số vật liệu chắnh sau
(i) Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides)
Ớ Cá mú bị bệnh lở loét xuất huyết: Gồm 24 con cá mú chấm cam E. coioides
có khối lượng thân từ 16 g Ờ 1.250 g, chiều dài thân từ 11,5 cm Ờ 41 cm ựược thu từ các vùng nuôi cá mú trên ựịa bàn tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu là Cam Ranh và Nha Trang. Mẫu cá thu có biểu hiện bệnh ựặc trưng là bỏ ăn, có các ựiểm xuất huyết lở loét trên da, vây xơ và mòn cụt. Khi thu mẫu, kết hợp ghi chép nguồn gốc cá, ngày thu, biểu hiện bệnh. Mẫu cá sống ựược bảo quản trong các thùng lạnh, có sục khắ trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thắ nghiệm. Tại phòng thắ nghiệm, cá ựược cân ựo khối lượng và kắch thước, sau ựó giải phẫu lấy mẫu bệnh phẩm tại gan, thận và phần cơ tại vết loét ựể nuôi cấy phân lập vi khuẩn.
Ớ Cá mú khỏe dùng cho các thắ nghiệm: Cá mú chấm cam khỏe ựược mua từ trại sản xuất giống tại Khánh Hòa. Chọn cá có kắch cỡ ựồng ựều, màu sắc cơ thể sáng, vận ựộng nhanh, không bộc lộ các dấu hiệu bệnh. Cá ựược nuôi thuần dưỡng ắt nhất 2 tuần trước khi tiến hành các thắ nghiệm.
(ii) Các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Gồm 4 chủng V. parahaemolyticus ựã ựược dùng trong nghiên cứu này, cụ thể như sau:
Ớ V. parahaemolyticus V3: phân lập từ thận cá mú nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa bị bệnh lở loét năm 2008, lưu giữ tại Phòng thắ nghiệm Bệnh và Môi trường, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III. đây là chủng có ựộc lực mạnh nhất ựược sàng lọc từ các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ cá mú bệnh (Phụ lục 1).
ỚV. parahaemolyticus V1: phân lập từ cá mú bệnh lở loét nuôi tại Cát Bà, Hải Phòng do Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch bệnh và môi trường khu vực miền Bắc, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I cung cấp.
ỚV. parahaemolyticus V2: cung cấp bởi Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch bệnh và môi trường khu vực miền Nam, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
ỚV. parahaemolyticus A: chủng V. parahaemolyticus 17802 mua từ ngân hàng chủng ATCC (American Type Culture Collection).
(iii) Chất kắch thắch miễn dịch β-glucan
Chất kắch thắch miễn dịch không ựặc hiệu sử dụng cho thắ nghiệm là sản phẩm β-glucan dạng bột với hàm lượng 99 % ựược tách chiết từ vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae do công ty Macrogardệ - Biorigin, Na Uy cung cấp.
2.1.3. địa ựiểm nghiên cứu
đề tài ựã thực hiện tại các ựịa ựiểm với các nghiên cứu cụ thể như sau:
(i) Phân lập, ựịnh danh vi khuẩn, phân tắch kháng thể, phân tắch các thông số miễn dịch không ựặc hiệu ựược thực hiện tại Phòng Nghiên cứu Bệnh và Môi trường - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, 33 đặng Tất, Nha Trang, Khánh Hòa.
(ii) Các thắ nghiệm cảm nhiễm xác ựịnh ựộc lực, ựánh giá ảnh hưởng của chất kắch thắch miễn dịch không ựặc hiệu và vi khuẩn bất hoạt ựến ựáp ứng miễn dịch ở cá mú ựược triển khai tại Trung tâm nuôi biển Sông Lô - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
(iii) định danh vi khuẩn, tinh sạch phân tử kháng thể Immunoglobuline lớp M (IgM) từ huyết thanh cá mú khỏe, phân tắch protein của vi khuẩn và IgM, tạo kháng huyết thanh thỏựối với IgM cá mú phục vụ cho các phương pháp phân tắch kháng thểựược thực hiện tại Phòng Nghiên cứu miễn dịch cá Ờ Bộ môn Sinh học Ờ Khoa Toán và Khoa học tự nhiên - Trường đại học Bergen, Na Uy.
2.1.4. Thời gian nghiên cứu
2.2. Sơ ựồ khối nội dung nghiên cứu chắnh của luận án
Hình 2.1 Sơ ựồ nội dung nghiên cứu 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu ựặc ựiểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 2.3.1.1. đặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Ớ Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh
Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh ựược thực hiện dựa theo phương pháp của Whitman (2004) [205]. Mẫu bệnh phẩm thu từ gan, thận và phần cơ tại vết loét của cá mú bệnh ựược cấy trên môi trường Trypticase Soya Agar (TSA; Difco), Trypticase Soya Broth (TSB; Difco) có bổ sung 2 % NaCl và môi trường chọn lọc vi khuẩn Vibrio là Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose Agar (TCBS Agar; Merck). Các chủng thuần sau khi phân lập ựược giữ trong môi trường TSB có bổ sung 20 % glycerol (Merck) ở -70 oC, hoặc ựông khô ựể lưu giống phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu ựáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides (Hamilton,1822) nuôi tại Khánh Hòa ựối với vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus đặc ựiểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú E. coioides đặc ựiểm phân tử kháng thể IgM của cá mú E. coioides đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu của cá mú E. coioides ựối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin đáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu của cá mú E. coioides với V. parahaemolyticus và ảnh hưởng của β-glucan ựến ựáp ứng miễn dịch này. KẾT LUẬN
ỚNuôi thu sinh khối
Vi khuẩn ựược nuôi thu sinh khối ở bình thủy tinh 50 mL chứa môi trường TSB có 2 % NaCl, ủở 33 oC trên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.
Ớ Xác ựịnh các ựặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và ựịnh danh vi khuẩn
Hình thái vi khuẩn ựược xác ựịnh bằng cách quan sát tế bào vi khuẩn ở các tiêu bản ép, nhuộm Gram (Difco) dưới kắnh hiển vi (CX31J, Olympus) ở ựộ phóng ựại 1000 lần sử dụng vật kắnh dầu (100 X).
Khả năng dung huyết của vi khuẩn ựược khảo sát theo phương pháp của Twedt et al. (1970) [202], trên môi trường thạch máu (Blood agar base Ờ BA, Difco) bổ sung 2 % NaCl và 5 % máu thỏ.
Các ựặc ựiểm sinh hóa ựược xác ựịnh dựa trên các bộ kắt API-20E và Biolog GN system (BioMerieux) với các bước thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, một số phản ứng sinh hóa khác cũng ựược làm thêm như: Oxidase, Catalase, O/F, O/129 (150 ộg) và xác ựịnh ựặc ựiểm sinh thái thông qua khả năng chịu ựựng ựộ mặn của vi khuẩn ở các nồng ựộ muối: 0, 3, 6, 8 và 10 %. Các phản ứng này thực hiện theo phương pháp của Whitman (2004) [205].
định danh vi khuẩn ựược thực hiện kết hợp 2 phương pháp: định danh theo phương pháp vi sinh vật học truyền thống dựa trên các ựặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa thu ựược và tra theo khóa phân loại của Bergey [90]. để kiểm chứng kết quả ựịnh danh theo phương pháp truyền thống, chủng V3 ựược ựịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tắch trình tựựoạn gen 16S rDNA theo phương pháp của Harris và Hartley (2003) [84] (Kết quả trình bày ở phụ lục 2).
2.3.1.2. Phân tắch thành phần protein của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus
Thành phần protein của 4 chủng V. parahaemolyticus ựược xác ựịnh bằng kỹ thuật Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) theo phương pháp của Tsang et al. (1983) [201]. Các bước tiến hành như sau:
Sau khi nuôi sinh khối, huyền dịch vi khuẩn ựược ly tâm 6.000 vòng/phút ở 4
oC trong 10 phút. Rửa và ly tâm 3 lần trong dung dịch Photphate Buffered Saline (PBS) ựể thu phần vi khuẩn kết lắng ở ựáy ống nghiệm. Xác ựịnh khối lượng vi
khuẩn thu ựược bằng cân phân tắch (AV-320, Shimadzu, Nhật). Pha loãng vi khuẩn trong dung dịch ựệm (950 ộl LaemmLi sample buffer, 50 ộl dung dịch 2-