Tiến hành đo đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4 dạng bột sấy khô ở nhiệt độ phòng sử dụng hệ đo là thiết bị từ kế mẫu rung. Mục đích của phép đo là xác định tính chất từ và từ độ bão hòa của mẫu Fe3O4. Kết quả thu được thể hiện trên hình 3.3:
-15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 M (H ) H (Oe) B
Hình 3.3: Đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4
Kết quả này cho ta thấy rằng lực kháng từ Hc=0, mặt khác có thể thấy rằng từ độ dư Mr=0, tức là không có hiệu ứng trễ hầu như không đáng kể, vậy có thể nhận xét được rằng các hạt nano từ tính Fe3O4 có tính chất siêu thuận từ. Đường cong là một đường đối xứng,
từ độ bão hòa (tính theo emu/g) là tương đối cao, cụ thể trên đồ thị ta có thể thấy MS=80 emu/g, trong khi đó từ độ bão hòa của mẫu khối là 90 emu/g, như vậy có thể thấy từ độ bão hòa của hạt nano từ tính Fe3O4 là tương đối cao, tuy nhiên vẫn thấp hơn giá trị từ độ bão hòa của mẫu khối.
3.2. Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 trong đánh dấu và tách chiết tế bào 3.2.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4
Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa bề mặt để gắn kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme. Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin, cacbonxyl, thiol. Để có được các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, người ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo ra môt lớp polymer trên bề mặt hạt nano [5].
Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là: X-(CH2)n- SiRn(OR’)3-n. Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với các đối tượng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng. SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano.
Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã được thương mại hóa. Trong các ứng dụng về sinh học thì nhóm chức amino được sử dụng nhiều nhất. Trong công trình này chúng tôi cũng đặt mục đích tạo ra nhóm chức amino NH2 để có thể gắn hạt nano từ tính với kháng thể antiCD4, và ứng dụng nó để phân tách tế bào bạch cầu trong máu [5].
Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm OH tự do trên bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững.
Trong quá trình tiến hành chức năng hóa bề mặt thì điều kiện của môi trường phản ứng có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt. Ví dụ như cồn thì thường làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm tăng cường quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS, n=2) để tạo ra nhóm chức amino trên bề mặt hạt nano. Quy trình chức năng hóa bề mặt gồm các bước như sau: Lấy 400 mg hạt nano từ tính cho vào 100 ml nước cất hai lần. Dùng máy siêu âm để phân tán hạt và dụng dịch để được một thể huyền phù ổn định. Nhỏ 1 ml dung dịch APTS vào trong dung dịch huyền phù nói trên và dùng máy khuấy từ để khuấy trong vòng 8 giờ cho quá trình chức năng hóa bề mặt xảy ra hoàn toàn. Kết thúc quá trình này ta thu được sản phẩm, đem lọc rửa 5 lần bằng lần bằng nước cất và lọc từ sẽ thu được hạt nano từ tính Fe3O4 có bề mặt là các nhóm amino. Lúc này hạt
quang của tế bào bạch cầu T. Kháng thể anCD4 là kháng thể có khả năng đối ứng với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T, nhờ khả năng phát huỳnh quang của kháng thể giúp cho việc đếm tế bào bạch cầu được dễ dàng hơn với độ chính xác cao [5].
Hình 3.4: Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 bằng nhóm amino sử dụng APTS (Hạt nano sau khi được chức năng hóa bề mặt được gọi tắt là Amino-NP).
Chúng tôi có tiến hành xác định số mol NH2 trên bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 đã được chức năng hóa bề mặt bằng APTS để xuất hiện nhóm chức NH2. Nguyên tắc của phép xác định này là dùng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) cho phản ứng với các hạt nano Fe3O4 có nhóm chức NH2 trên bề mặt, sau đó đo dung dịch sau phản ứng bằng phép đo phổ hấp thụ (UV Vis), phép đo sẽ xác định số lượng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) ở trong dung dịch, từ đó có thể xác định được số nhóm amino trên bề mặt hạt nano. Trong cấu tạo phân tử của 4-Nitrobenzaldehyde có tồn tại cấu trúc vòng benzen 6 cạnh, vì vậy khi đo phổ hấp thụ UV-Vis sẽ cho các đỉnh hấp thụ tương ứng với các nồng độ khác nhau. Phổ hấp thụ cho thấy ở bước sóng 270 nm thì có các đỉnh hấp thụ như hình 3.5:
150 200 250 300 350 400 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 In te ns ity wave number (cm-1) sample 30 microgram/ml sample 27 microgram/ml sample 24 microgram/ml sample 18 microgram/ml sample 15 microgram/ml sample 12 microgram/ml
Hình 3.5: Phổ hấp thụ của dung dịch chứa 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ khác nhau.
Sau khi tiến hành đo phổ hấp thụ xong có thể xây dựng một đường miêu tả sự phụ thuộc của nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde có trong dung dịch với cường độ phổ hấp thụ và đem so sánh với một đường chuẩn của 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ tương ứng. Hình dưới là đồ thị miêu tả sự so sánh đó.
Hình 3.6: Đường cong mô tả mối liên hệ giữa nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde và cường độ phổ hấp thụ trong trường hợp thực nghiệm và chuẩn.
Từ các đỉnh hấp thụ đo được trong thực tế và so sánh với đường chuẩn của 4-
Nitrobenzaldehyde mà có thể xác định được nồng độ tương ứng với các đỉnh hấp thụ đó và có thể thấy rằng các nồng độ này bằng và cao hơn một số nghiên cứu khác.
Bảng 3.1: Cường độ phổ hấp thụ và nồng độ tương ứng với các mẫu
10 15 20 25 30 35 40 45 50 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 In te ns ity Concentration (microgram/mL) (Standardisation of 4-Nitrobenzaldehyde) (Solution)
3.2.2. Đánh dấu tế bào và tách chiết tế bào
3.2.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe3O4 với kháng thể antiCD4
Quá trình gắn với kháng thể antiCD4 được thực hiện như sau: Lấy 0,4 g hạt nano từ tính đã được chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amino sử dụng APTS (amino-NP) đem rửa và tách từ hai lần bằng 1ml dung dịch đệm 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) có pH bằng 6 và nồng độ là 0,1M. Sau đó amino-NP được phân tán trong 0,25 ml dung dịch đệm chứa MES và 2mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ở dạng bột bằng cách khuấy đều tại nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. Tách rửa bằng từ trường hai lần trước khi nhỏ 1 µg–100 µg kháng thể đơn dòng antiCD4 (antiCD4, Invitrogen). Tách rửa từ bốn lần bằng nước cất ta thu được hạt nano gắn kháng thể antiCD4, gọi tắt là antiCD4-NP.
Trong một số mẫu, chúng tôi có sử dụng 20 µl kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang (gọi tắt là *antiCD4, bước sóng kích thích là 480 nm, bước sóng phát xạ 520 nm
Cường độ Nồng độ (µg/ml) 0,683 13,182 0,939 18,044 1,377 26,988 1,873 36,592 2,089 40,794 2,408 46,577
nano được bọc bởi các kháng thế đơn dòng antiCD4 và *antiCD4 được tách rửa từ 3 lần bằng 1ml dung dịch đệm phosphate saline (PBS) [5].
Kết quả cuối cùng ta thu được hạt nano từ bọc bởi 2 loại kháng thể đơn dòng antiCD4: một loại thường (gọi tắt là antiCD4-NP) và loại kia phát huỳnh quang (gọi tắt là *antiCD4-NP) và chúng được bảo quản trong PBS bổ sung thêm albumin huyết thanh bò (BSA).
Hình 3.7: Quy trình gắn kết hạt nano được chức năng hóa với kháng thể antiCD4. Phản ứng (A) Hạt nano từ tính được chức năng hóa EDC. Phản ứng (B) Gắn kết kháng
thể antiCD4 với hạt nano từ tính được bao phủ bởi EDC.
Lấy 200 µl máu người bình thường được li tâm trong ống nghiệm Eppendorf 1,5 ml với tốc độ 1000 vòng / phút trong vòng 10 phút để loại bỏ huyết thanh rồi hòa vào 200 µl PBS bổ sung 1% BSA. Sau đó được ủ với 0,2 mg antiCD4-NP và *antiCD4-NP trong vòng 20 phút ở nhiệt độ phòng. Bổ sung 1,3 ml dung dịch đệm nhược trương (5 mM Tris pH 7.0, 10% glycerol) để đột ngột phá tung màng tế bào máu làm tế bào trở thành dạng ko có bào quan và bào tương hay còn gọi là tế bào ma.
Lúc này các antiCD4-NP và *antiCD4-NP sẽ gắn đặc hiệu lên các tế bào bạch cầu CD4+ T thông qua tương tác kháng nguyên -kháng thể và được tách lọc bằng từ trường, giúp loại bớt các tế bào ma. Trong thí nghiệm được tiến hành để đối chứng, chúng tôi tiến hành gắn trực tiếp 20 µl kháng thể đơn dòng antiCD4 phát huỳnh quang với 200 µl máu để nhuộm tế bào bạch cầu CD4+ T, quá trình xử lí tiếp theo cũng được tiến hành tương tự như trên chỉ khác là không có tuyển từ.
Các tế bào sau khi phản ứng gắn đặc hiệu với kháng thể được bảo quản trong 50 µl PBS lạnh, bổ sung 1% ABS và 10% glycerol. 5 µl dung dịch chứa tế bào được nhỏ lên một tấm kính (slide glass) rồi được phủ lên bằng một phiến kính mỏng (cover glass) để tiến hành quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axio. Cường độ phát huỳnh quang được xử lý bằng phần mềm Scion Image.
Một số hình ảnh về các tế bào được chụp từ kính hiển vi huỳnh quang
Hình 3.8 là ảnh chụp các tế bào trong máu từ kính hiển vi dưới ánh sáng thường (3.8A, 3.8C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm và ánh sáng huỳnh quang 520nm (3.8B, 3.8D). Đối với các mẫu được chụp trên hình 3.8 chưa được tuyển từ nên dưới ánh sáng thường (3.8A, 3.8C) có thể nhìn thấy tế bào hồng cầu và nhiều loại tế bào bạch cầu. Có thể nhận biết được loại tế bào dựa vào hình dạng của chúng. Khi chụp dưới chế độ phát huỳnh quang (3.8B, 3.8D) thì chỉ quan sát thấy tế bào bạch cầu CD4+ T mà không quan sát thấy các tế bào hồng cầu và các tế bào bạch cầu dạng khác. Lý do là vì các kháng thể đơn dòng antiCD4 phát huỳnh quang rất đặc hiệu, chỉ gắn với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T và làm cho các tế bào này phát sáng.
Hình 3.8: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T riêng lẻ được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C ) và dưới ánh sáng kích thích (480 nm) (B, D) sau
khi chúng được gắn kết với kháng thể đơn dòng phát huỳnh quang antiCD4.Mũi tên chỉ các tế bào bạch cầu CD4+ T.
Còn trong hình 3.9 cũng là hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (3.9A, 3.9C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm (3.9B, 3.9D) nhưng khác so với mẫu ở hình 3.8 là các tế bào này được được gắn kết với các hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể phát huỳnh quang antiCD4 (*antiCD4-NP) và đã được tuyển từ. Không giống như hình 3.8 trong hình 3.9 không thấy xuất hiện nhiều các tế bào hồng cầu hay tế bào bạch cầu
loại khác. Hơn nữa tín hiệu thu được dưới chế độ ảnh chụp huỳnh quang (3.9B, 3.9D) cho thấy cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu CD4+ T mạnh hơn cường độ phát huỳnh quang của tế bào được gắn kết với kháng thể huỳnh quang mà không có hạt nano.
Hình 3.9: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C) và dưới ánh sáng kích thích (480nm) (B, D) sau khi được gắn
kết với hạt nano đã được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang. Mũi tên chỉ các tế bào bạch cầu CD4+ T.
3.2.2.3. Nhận xét:
Độ sáng của tế bào bạch cầu trong trường hợp không có hạt nano từ tính là (137±45)x103 (đơn vị tùy ý), trong khi đó nếu có hạt nano từ tính thì độ sáng của tế bào bạch cầu đo được là (356±64)x103 (đơn vị tùy ý ), như vậy là gấp 2,6 lần. Như vậy có thể thấy rằng quá trình tách lọc tế bào sử dụng tương tác kháng nguyên - kháng thể đã thành công, ngoài ra còn có thể tăng cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu bằng cách sử dụng hạt nano từ tính Fe3O4, có thể giải thích điều này như sau: khi không có hạt nano từ tính thì chỉ có một lớp kháng thể huỳnh quang bám được trên bề mặt của tế bào nên cường độ phát huỳnh quang của tế bào chỉ do một lớp này quyết định, ngược lại trong trường hợp có hạt nano từ tính, sẽ có nhiều kháng thể huỳnh quang hơn gắn với hạt nano trước khi gắn kết trên bề mặt tế bào bạch cầu, tạo nên nhiều lớp kháng thể huỳnh quang nên có được độ sáng lớn hơn so với trường hợp không có hạt nano.
Ngoài ra dựa trên diện tích các hình nghiên cứu vào khoảng 104 µm2, chúng tôi ước tính được số lượng tế bào bạch cầu CD4+ T trong máu của 2 người trưởng thành 670 và 810 tế bào/µl. Giá trị này nằm trong khoảng an toàn đối với người khỏe mạnh (600 đến 1200 tế bào/µl). Với những người bị nhiễm HIV, số lượng tế bào bạch cầu giảm đi rất nhiều, thậm chí là ít hơn 150 tế bào/µl nên việc lấy thống kê theo diện tích trên hình quan sát trên kính hiển vi là không được chính xác. Chính vì vậy chúng tôi đã ứng dụng hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt bằng kháng thể antiCD4 để làm giàu tế bào bạch cầu trước khi đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang. Sau khi thử nghiệm ở các nồng độ antiCD4 khác nhau từ 1µg – 100 µg thì thấy rằng ở 20 µg là đủ để chức năng hóa bề mặt của 0,4 g hạt nano. Việc đếm tế bào cũng sẽ trở nên dễ dàng hơn vì không bị lẫn với các tế bào khác và có nhiều tế bào trên một đơn vị diện tích nên thống kê được chính xác hơn. Phương pháp đánh dấu tế bào kết hợp với tuyển từ như vậy rất hiệu quả trong việc đếm tế bào bạch cầu CD4+ T cho các bệnh nhân bị nhiễm HIV.
3.3. Ứng dụng hạt nano Fe3O4 trong xử lý nước bị nhiễm bẩn3.3.1. Chế tạo mẫu 3.3.1. Chế tạo mẫu
Các hạt nano ôxit sắt với diện tích bề mặt lớn hứa hẹn có thể tách bỏ được asenic. Các hạt nano từ tính thì có từ độ bão hòa cao cỡ 90 emu/g so với các ôxit sắt, do đó các hạt nano từ tính có thể được sử dụng để hấp thụ asenic và tách lọc bằng từ tính. Một số ôxit và hydroxit sắt khác cũng được nghiên cứu để hấp thụ asenic song tính chất từ của
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 40 50 60 70 80 M s ( em u/ g) x Co-ferrite
những hợp chất này thì không bằng được so với hạt nano từ tính. Tuy nhiên có một khó khăn đặt ra là sự ôxi hóa của oxit sắt làm giảm đi từ độ bão hòa [4]. Vì vậy chúng tôi có nghiên cứu một phương án là thay thế ion Fe2+ trong Fe3O4 bằng ion Co2+ để nâng cao khả năng chống oxi hóa của hợp chất. Khả năng chống oxi hóa là một thông số quan trọng để loại bỏ asenic trong điều kiện thông thường. Trong khóa luận này chúng tôi nghiên cứu khả năng hấp thụ asen của hạt nano Fe1-xCoxFe2O4 (Co-ferrites) với x=0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5. Tương tự như trong trường hợp chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 thì các hạt nano
Fe1-xCoxFe2O4 (Co-ferrites) cũng được chế tạo tương tự nhưng thay vì sử dụng ion Fe2+ chúng ta thay bằng ion Co2+ với CoCl2.6H2O tương ứng, và các quy trình tạo mẫu được