2.2.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
- Bố trí thí nghiệm khảo sát sự thay đổi khối lƣợng và pH của nguyên liệu theo thời gian bảo quản theo phƣơng pháp cổ điển.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của việc bổ sung enzym bên ngồi đến HQKP/HQKK khi thay đổi thời gian bảo quản theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm trên phần mềm DX.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của đối tƣợng nguyên liệu đến HQKP khi cĩ và khơng bổ sung enzym theo phƣơng pháp cổ điển.
2.2.2. Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu
2.2.2.1. Xác định hàm lượng protein trên chitin (cịn lại trong bã sau thủy phân bằng cách chiết protein sau đĩ định lượng bằng phương pháp Biuret).
Hàm lƣợng protein trên chitin đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp Biuret sử dụng Bovine Serum Albumin (Sigma) làm chất chuẩn theo qui trình của Aye và cộng sự, cĩ điều chỉnh [19].
Nguyên lý: Trong mơi trƣờng kiềm, protein kết hợp với Cu2+ thành một phức chất màu tím (phản ứng Biuret). Màu sắc của phức chất tỉ lệ với số lƣợng liên kết peptide (CO-NH-) của protein và gần nhƣ khơng phụ thuộc vào nồng độ tƣơng đối giữa albumin và globulin.
Cơng thức của phức Biuret nhƣ sau:
Hình 2.1. Cơng thức của phức Biuret
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị thuốc thử Biuret: hịa tan 2,34375g CuSO4.5H2O và 8,0571g C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nƣớc cất, khuấy đều và cho thêm 300ml dung dịch NaOH 10%. Dung dịch trên đƣợc khuấy đều và định mức lên 1000ml bằng nƣớc cất.
Dung dịch BSA chuẩn đƣợc pha nhƣ sau: hịa tan 0.5g BSA vào 50ml nƣớc cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100 ml nƣớc cất. Cuối cùng thu đƣợc dung dịch BSA cĩ hàm lƣợng 10mg/ml.
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự 0 - 5. Sau đĩ cho các dung dịch hĩa chất vào với thể tích nhƣ sau:
Bảng 2.1. Thể tích các dung dịch hĩa chất cho vào ống nghiệm
Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm
0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nƣớc cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lƣợng BSA 0 2 4 6 8 10
Sau khi đã cho đầy đủ các hĩa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ tiến hành so màu ở bƣớc sĩng 570nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
Dựa vào mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng protein và độ hấp thụ quang học để thiết lập phƣơng trình đƣờng chuẩn protein.
Phƣơng trình đƣờng chuẩn cĩ dạng Y = a* X + b (1) Trong đĩ: Y: Độ hấp thụ quang học tại bƣớc sĩng 570nm. X: Hàm lƣợng protein (mg/ml) a, b: Hệ số.
- Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu
(w/v) vào dụng cụ ủ, tiến hành ủ ở 800C trong 8 giờ.
Sau khi ủ, phần bã và phần dịch đƣợc tách riêng bằng thiết bị lọc chân khơng. Phần dịch lọc đƣợc định mức đến một thể tích xác định bằng nƣớc cất (V1).
Lấy 10ml dịch lọc ở trên tiến hành lọc lần 2 qua giấy lọc Whatman filter paper No1.
Cho 1ml dịch vào ống nghiệm, cho thêm 4ml thuốc thử Biuret, vortex và ủ 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau khi ủ, mang các mẫu so màu trên máy so màu ở bƣớc sĩng 570nm, ta xác định đƣợc giá trị Ym. Thay giá trị Ym vừa tính đƣợc vào phƣơng trình (1) ta sẽ xác định đƣợc giá trị Xm.
- Tính kết quả.
Hàm lƣợng % protein cịn lại trong mẫu đƣợc xác định theo cơng thức sau: % proteinconlai = 1000 * 100 100 * 100 * * 1 MC W Xm V Trong đĩ: V1: thể tích dịch lọc định mức (ml) Xm: Hàm lƣợng protein trong 1ml dịch lọc (mg/ml) W: Khối lƣợng mẫu khơ thu đƣợc (g)
MC: Hàm ẩm (%)
Khối lƣợng protein cịn lại trong mẫu đƣợc xác định theo cơng thức sau: A = 100 100 100 Pr % oteinconlai MC W
Xác định hiệu quả khử protein (%): Hiệu quả khử protein =
B A
Trong đĩ:
B: Lƣợng protein trong nguyên liệu A: Lƣợng protein cịn lại trong mẫu
2.2.2.2. Xác định hàm lượng ẩm theo phương pháp sấy khơ đến khối lượng khơng đổi
• Cách tiến hành: Sấy cốc đến trọng lƣợng khơng đổi ở nhiệt độ 105oC, cân trên cân phân tích (sai số 10-3g). Cho vào cốc khoảng 3 – 5 g mẫu thử, cân tất cả trên cân phân tích cĩ độ chính xác nhƣ trên. Sau đĩ cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105o C, sấy đến trọng lƣợng khơng đổi, thời gian 16h, sấy xong đem làm nguội ở bình hút ẩm 30 phút và cân trên cân phân tích.
• Tính kết quả: X Trong đĩ:
X: Hàm lƣợng ẩm (%) G: Trọng lƣợng cốc (g)
G1: Trọng lƣợng cốc + mẫu thử trƣớc khi sấy (g) G2: Trọng lƣợng cốc + mẫu thử sau khi sấy (g).
2.2.2.3. Xác định hàm lượng khống tổng số theo phương pháp nung đến khối lượng khơng đổi.
• Cách tiến hành: Cốc sứ đã rửa sạch cho vào tủ nung tới 6500C đến trọng lƣợng khơng đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân trên cân phân tích cĩ độ chính xác 10-3 g. Cho vào cốc sứ đã nung khoảng 2 g mẫu, cân tất cả trên cân phân tích cĩ độ chính xác nhƣ trên. Cho cốc mẫu hĩa tro đen ở bếp điện trong tủ Host, đến khi thành tro đen, cho vào nung ở nhiệt độ 6500C, nung đến tro trắng, thời gian khoảng 16h, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút và cân. Tiếp tục nung trong 1 giờ và cân lại nếu giữa hai quá trình cân khơng chênh lệch quá 0,01g là dừng.
• Tính kết quả: X = (%) Trong đĩ: X: Hàm lƣợng tro (%) G: Trọng lƣợng cốc (g) G1: Trọng lƣợng cốc + mẫu thử (g) G2: Trọng lƣợng cốc + tro (g)
2.2.2.4. Xác định hiệu quả khử khống và protein
Hiệu quả khử protein/khử khống là tỷ lệ phần trăm của lƣợng protein/khống tách đƣợc so với lƣợng protein/khống cĩ trong mẫu tƣơng ứng trƣớc khi xử lý, đƣợc xác định bằng cơng thức:
DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/( P0*O) DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/( A0*O) Trong đĩ:
- P0, PR: Hàm lƣợng protein (g/g) tƣơng ứng của mẫu trƣớc và sau xử lý - A0, AR: Hàm lƣợng khống (g/g) tƣơng ứng của mẫu trƣớc và sau xử
lý
- O, R: Khối lƣợng (g) tƣơng ứng của mẫu trƣớc và sau xử lý
2.2.2.5 Xác định mức độ hao hụt khối lượng
Mức độ hao hụt khối lƣợng là tỉ lệ phần trăm của khối lƣợng mẫu hao hụt so với khối lƣợng mẫu ban đầu (trƣớc bảo quản), đƣợc xác định bằng cơng thức:
Hao hụt (%) = (m0 – m)*100/m0 Trong đĩ: m0: khối lƣợng mẫu trƣớc bảo quản (g)
m: khối lƣợng mẫu sau bảo quản (g)
2.2.2.6. Xác định pH
Cách tiến hành: Cân chính xác 100g nguyên liệu cho vào bình tam giác, sau đĩ bổ sung thêm 100ml nƣớc cất, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo đều mẫu trong
bình. Hiệu chỉnh lại pH kế trƣớc khi đo bằng dung dịch pH chuẩn. Sau đĩ đổ dung dịch trong bình tam giác ra một cốc thủy tinh sạch, đặt pH kế đã hiệu chỉnh vào, đọc và ghi lại giá trị hiện trên pH kế.
2.2.3 Phƣơng pháp xử lí số liệu
Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm MINITAB 16 và DX6 với p=0.05. Sử dụng phần mềm Excel 2007 để vẽ đồ thị. Số liệu biểu diễn là trung bình cộng của 3 lần lặp.
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Khảo sát sự thay đổi khối lƣợng và pH của nguyên liệu theo thời gian bảo quản bảo quản bảo quản
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu sự thay đổi khối lƣợng và pH của nguyên liệu theo thời gian bảo quản
Đầu tơm
Cân lần 1
Bảo quản ở nhiệt độ phịng
=8h =7h =6h =5h =4h =3h =2h =1h =0h
Cân lần 2, xác định mức độ hao hụt khối lƣợng
Đo pH
Mơ tả quy trình: Đầu tơm sau khi thu mua tại cơng ty về sẽ đƣợc đem đi rửa và để ráo. Sau đĩ cân và chia đều thành 9 lơ, khối lƣợng mỗi lơ là 200g. Các lơ nguyên liệu đƣợc đựng trong các rổ đã biết khối lƣợng. Sau thời gian bảo quản tƣơng ứng với mỗi lơ là 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h ta sẽ tiến hành cân lại khối lƣợng của lơ đĩ và đo giá trị pH của mẫu trong lơ.
2.3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của việc bổ sung enzyme bên ngồi đến hiệu quả khử protein/khử khống khi thay đổi thời gian bảo quản. khử protein/khử khống khi thay đổi thời gian bảo quản.
Hình 2.3. Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng của việc bổ sung enzyme bên ngồi đến HQKP/HQKK khi thay đổi thời gian bảo quản.
Đầu tơm mua ở cơng ty
Bảo quản ở nhiệt độ phịng
=0h =2h =4h =5h
Khơng bổ sung enzym Bổ sung enzym Alcalase 0.2%
Thuỷ phân (60oC, 2h) Bất hoạt Enzym (900C, 10 phút) Xay Dịch thuỷ phân Lọc Bã
Rửa và phơi khơ Xác định các chỉ tiêu
Hàm lƣợng protein
Độ ẩm Hàm lƣợng tro
Xử lí thống kê, so sánh và đƣa ra kết luận
Loại bỏ Đầu tơm mua ở
Mơ tả quy trình:
Đầu tơm sau khi thu mua ở chợ và cơng ty sẽ đƣợc đem đi rửa và để ráo. Cân và chia đều mẫu thành 4 lơ. Mỗi lơ tƣơng ứng với một thời gian bảo quản là 0h, 2h, 4h, 5h. Sau các thời gian bảo quản tƣơng ứng với mỗi lơ tiến hành cân và chia đều mẫu (mỗi mẫu nặng 200g) cho vào 2 bình tam giác 500ml, bổ sung nƣớc với tỉ lệ 1/1. Một mẫu khơng bổ sung enzym cịn mẫu cịn lại bổ sung enzym Alcalase với nồng độ 0.2%. Các mẫu sẽ đƣợc duy trì ổn nhiệt ở 600C, 2 giờ trong bể ổn nhiệt, thực hiện khuấy đảo định kì trong quá trình ủ.
Khi kết thúc quá trình thủy phân, lấy các bình tam giác ra khỏi bể ổn nhiệt rồi chuyển qua nồi nƣớc 90oC tiếp tục gia nhiệt để trung tâm bình đạt lên 900C, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút nhằm bất hoạt enzym để kết thúc quá trình thủy phân.
Khi thời gian bất hoạt enzym kết thúc lấy các bình tam giác ra khỏi nồi và làm nguội mẫu bằng nƣớc ấm cĩ nhiệt độ chênh lệch khơng quá 200C so với hỗn hợp thủy phân để tránh hiện tƣợng sốc nhiệt làm bể bình.
Khi mẫu đã nguội đến khoảng 400C tiến hành chuyển mẫu từ bình tam giác qua máy xay, thực hiện chế độ xay nhồi trong 2 phút để tách phần bã và phần thịt riêng ra. Sau đĩ đổ hỗn hợp vào rây và tiến hành rửa dƣới vịi nƣớc. Phần bã đƣợc rửa sạch bằng nƣớc sạch, phơi khơ trƣớc khi xác định các chỉ tiêu: độ ẩm, hàm lƣợng protein và hàm lƣợng tro. Từ kết quả thu đƣợc đem phân tích ảnh hƣởng của việc bổ sung enzyme bên ngồi đến HQKP và HQKK trên đầu tơm thẻ chân trắng khi thay đổi thời gian bảo quản.
Ma trận thí nghiệm đƣợc thiết kế theo mơ hình thí nghiệm General Factorial trên phần mềm DX6 đƣợc trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.2: Ma trận thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của chất lƣợng nguyên liệu và việc bổ sung enzyme.
std run block CLNL Enzym
1 6 Block 1 0h Cĩ 2 9 Block 2 0h Cĩ 3 17 Block 3 0h Cĩ 4 7 Block 1 2h Cĩ 5 12 Block 2 2h Cĩ 6 23 Block 3 2h Cĩ 7 3 Block 1 4h Cĩ 8 15 Block 2 4h Cĩ 9 20 Block 3 4h Cĩ 10 1 Block 1 5h Cĩ 11 16 Block 2 5h Cĩ 12 22 Block 3 5h Cĩ 13 2 Block 1 0h Khơng 14 14 Block 2 0h Khơng 15 19 Block 3 0h Khơng 16 8 Block 1 2h Khơng 17 10 Block 2 2h Khơng 18 18 Block 3 2h Khơng 19 4 Block 1 4h Khơng 20 13 Block 2 4h Khơng 21 21 Block 3 4h Khơng 22 5 Block 1 5h Khơng 23 11 Block 2 5h Khơng 24 24 Block 3 5h Khơng
2.3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của đối tƣợng nguyên liệu đến hiệu quả khử protein khi cĩ và khơng bổ sung enzyme. khi cĩ và khơng bổ sung enzyme.
Hình 2.4. Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng của đối tƣợng nguyên liệu đến hiệu quả khử protein khi cĩ và khơng bổ sung enzyme.
Đầu Đầu và vỏ
Vỏ
Rửa, để ráo
Khơng bổ sung enzym Bổ sung enzym Alcalase 0.2%
Thuỷ phân (60oC, 2h)
Bất hoạt Enzym (900C, 10 phút)
Dịch thuỷ phân Lọc
Bã
Rửa và phơi khơ
Xác định các chỉ tiêu
HQKP Độ ẩm
Loại bỏ Xay
Mơ tả quy trình:
Đầu tơm, vỏ tơm sau khi thu mua ở cơng ty và chợ về sẽ đƣợc đem đi rửa và để ráo. Sau đĩ đem nguyên liệu đi cân và chia mỗi loại nguyên liệu thành 2 lơ (mỗi lơ 200g) và cho vào các bình tam giác 500ml. Với nguyên liệu là hỗn hợp đầu vỏ tơm, một lơ 200g đƣợc tạo ra bằng cách trộn 100g đầu với 100g vỏ. Tiến hành bổ sung nƣớc với tỉ lệ 1/1. Một mẫu khơng bổ sung enzym cịn mẫu cịn lại bổ sung enzym Alcalase với nồng độ 0.2%. Các mẫu sẽ đƣợc duy trì ổn nhiệt ở 600C, 2 giờ trong bể ổn nhiệt, thực hiện khuấy đảo định kì trong quá trình ủ.
Khi kết thúc quá trình thủy phân, lấy các bình tam giác ra khỏi bể ổn nhiệt rồi chuyển qua nồi nƣớc 90oC tiếp tục gia nhiệt để trung tâm bình đạt lên 900C, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút nhằm bất hoạt enzym để kết thúc quá trình thủy phân.
Khi thời gian bất hoạt enzym kết thúc lấy các bình tam giác ra khỏi nồi và làm nguội mẫu bằng nƣớc ấm cĩ nhiệt độ chênh lệch khơng quá 200C so với hỗn hợp thủy phân để tránh hiện tƣợng sốc nhiệt làm bể bình.
Khi mẫu đã nguội đến khoảng 400C tiến hành chuyển mẫu từ bình tam giác qua máy xay, thực hiện chế độ xay nhồi trong 2 phút để tách phần bã và phần thịt riêng ra. Sau đĩ đổ hỗn hợp vào rây và tiến hành rửa dƣới vịi nƣớc. Phần bã đƣợc rửa sạch bằng nƣớc sạch, phơi khơ trƣớc khi xác định các chỉ tiêu: độ ẩm, hàm lƣợng protein. Từ kết quả thu đƣợc đem phân tích ảnh hƣởng của đối tƣợng nguyên liệu đến HQKP trên đầu tơm thẻ chân trắng khi cĩ và khơng bổ sung enzym.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Khảo sát sự thay đổi khối lƣợng và pH của nguyên liệu theo thời gian bảo quản. 3.1.1. Sự hao hụt khối lƣợng của đầu tơm theo thời gian bảo quản:
Hình 3.1: Hao hụt khối lƣợng đầu tơm theo thời gian bảo quản
Các chữ cái khác nhau trên các cột phản ánh mức độ khác nhau cĩ ý nghĩa (p< 0,05)
Kết quả xác định hao hụt khối lƣợng đầu tơm theo thời gian bảo quan ở hình 3.1 cho thấy khi kéo dài thời gian bảo quản thì sự hao hụt khối lƣợng của đầu tơm tăng dần, sau 8 giờ mức độ hao hụt đạt đến 8.21%. Nguyên nhân cĩ thể giải thích nhƣ sau: Khi thời gian bảo quản tăng thì mức độ biến đổi protein tăng và khả năng giữ nƣớc trong đầu tơm sẽ giảm dần và khi đĩ nƣớc dễ bị thốt ra ngồi, kéo theo những chất dinh dƣỡng hịa tan làm cho khối lƣợng của phế liệu giảm đi so với ban đầu, hay sự hao hụt khối lƣợng sẽ tăng lên theo thời gian bảo quản.
Nhƣ vậy để giảm sự hao hụt xuống mức thấp nhất nên đem nguyên liệu đi sản xuất càng sớm càng tốt. 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h Hao hụt (% )
Thời gian bảo quản (giờ)
Hao hụt khối lƣợng (%) c a a ab ab b c c c
3.1.2. Sự thay đổi pH của đầu tơm theo thời gian bảo quản
Hình 3.2: Sự thay đổi pH của đầu tơm theo thời gian bảo quản
Các chữ cái khác nhau trên các cột phản ánh mức độ khác nhau cĩ ý nghĩa (p< 0,05). Kết quả nghiên cứu ở hình 3.2 cho thấy pH tăng dần theo thời gian bảo quản. Cụ thể pH của mẫu tƣơi (0 giờ bảo quản) là 7,5 sau 8 giờ bảo quản pH tăng lên đạt giá trị 8,5.
Điều này cĩ thể đƣợc giải thích nhƣ sau: trong thời gian bảo quản, sự trao đổi khí, ẩm với mơi trƣờng bên ngồi, tạo điều kiện cho sự xâm nhập vi sinh vật