hồi các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học từ nguyên liệu cịn lại
Theo phƣơng pháp sinh học tại cơng đoạn khử protein khơng sử dụng hố chất mà cĩ thể sử dụng vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để. Sản phẩm chittin, chitosan thu đƣợc cĩ chất lƣợng cao do khơng bị ảnh hƣởng nhiều bởi hĩa chất [7]. Các cơng đoạn cơ bản của phƣơng pháp này đƣợc
thực hiện nhƣ sau: nguyên liệu khử protein (bổ sung protease hoặc vi sinh vật cĩ khả năng sinh protease) khử khống chitin. Phản ứng thủy phân protein tạo thành các peptid, amino acid hịa tan vào mơi trƣờng.
Việc sử dụng phƣơng pháp sinh học cũng gặp rất nhiều khĩ khăn nhƣ giá thành sản phẩm cĩ thể sẽ cao tùy thuộc vào enzyme sử dụng, việc loại bỏ hồn tồn protein cĩ thể đạt đƣợc bằng phƣơng pháp hĩa học nhƣng khơng thể đạt đƣợc bằng phƣơng pháp sinh học [16]. Vì vậy, ngƣời ta cĩ thể kết hợp hai phƣơng pháp này nhằm khắc phục những nhƣợc điểm của từng phƣơng pháp.
Hiện nay, một trong những nhƣợc điểm của từng phƣơng pháp hĩa học để sản xuất chitin là thể tích chất thải cĩ chứa các chất ăn mịn, các chất lơ lửng khĩ xử lý quá lớn. Những chất này là do trong cơng đoạn khử khống và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải cĩ các biện pháp xử lý trƣớc khi thải ra mơi trƣờng và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phƣơng pháp hĩa học cĩ thể gây nên sự thủy phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994), biến đổi tính chất vật lí (Gagne và Simpson, 1993) dẫn đến sản phẩm chitin cĩ chất lƣợng thấp và gây ơ nhiễm mơi trƣờng (Allan và cộng sự, 1978[16]. Điều này là do khơng xác định đƣợc bản chất hoạt động của hĩa chất cũng nhƣ sự khác nhau về hàm lƣợng chitin trong nguyên liệu. Ngƣợc lại, trong phƣơng pháp sinh học thì thể tích chất khơng lớn, sản phẩm chitin thu đƣợc cĩ sự đồng nhất hơn về đặc tính lý hĩa, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme cĩ thể đƣợc thu hồi làm bột dinh dƣỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác nhƣ lipid, các sắc tố cũng đƣợc thu hồi. Hơn nữa sẽ hạn chế đƣợc việc xử lý mơi trƣờng.
Việc nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin –chitosan đã đƣợc biết đến từ lâu, nhƣng nổi bật nhất vẫn là những nghiên cứu vào cuối những năm tám mƣơi và đầu những năm chín mƣơi trở lại đây.
Shimahara và cộng sự, 1984 [21] cơng bố việc khử protein phế liệu giáp xác với việc sử dụng protease sản xuất từ vi khuẩn nhƣ Pseudomonas maltophilia
LC – 102.
Gagne và Simpson, 1993 [15] đầu tƣ ứng dụng chymotrypsin và papain để khử protein của phế liệu tơm. Nghiêm cứu chỉ ra protein cịn lại trong phế liệu sau khi thủy phân là 1,3% và 2,8% tƣơng ứng với các mẫu đƣợc xử lý bằng enzyme chymotrysin và papain.
Cĩ một vài nghiêm cứu so sánh hiệu quả thủy phân protein giữa enzyme và vi khuẩn. Bustos và Michael, 1994 [14] tìm thấy Pseudomonas maltophilia khử đƣợc 82% protein sau 6 ngày thủy phân, cịn protease từ vi khuẩn thấp hơn 64% trong cịng điều kiện thủy phân.
Wang và Chio, 1998 [26] cơng bố việc khử protein phế liệu giáp xác bằng
Pseudomonas aeruginosa K – 187. Sau 5 ngày thủy phân khử đƣợc 82% protein từ vỏ và đầu tơm. Kết quả này cũng rất gần với 82% sau 6 ngày thủy phân bằng
Pseudomonas maltophilia ghi nhận bởi Bustos và Michael, 1994.
Shimahara và Takiuchi, 1998 [22] đã sử dụng P. matophilia vào việc thủy phân protein từ các mảnh vỡ đã tách khống và thấy rằng hàm lƣợng protein cịn lại 5% và 8% sau 8 ngày thủy phân.
Để hiểu thêm về khả năng khử protein của enzyme protease, Jen-kuo Yang và cộng sự 1999 [27] sử dụng protease từ bacillus subtilis ở nhiệt độ 500C, pH 8,0 để khử protein từ vỏ tơm, vỏ ghẹ và vỏ tơm hùm trong cơng nghệ sản xuất chitosan. Kết quả đã loại bỏ đƣợc 88%, 67%, 83% protein theo thứ tự.
Synowiecki và cộng sự, 2000 [23] nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tơm Crangon crangon nhằm thu hồi chitin và protein. Ban đầu vỏ tơm Crangon crangon đƣợc khử khống sơ bộ bằng dung dịch HCL 10% ở 20oC trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thƣơng mại Alcalase ở 55oC và ph 8,5. Dịch thủy phân thu đƣợc chứa 63% protein so với vật chất khơ (Nx6,25),
6,24% lipid, 23,4% NaCl. Hàm lƣợng protein cịn lại sau thủy phân khoảng 4% cĩ thể là do trong quá trình thủy phân cĩ sự kết hợp khử protein bằng NaOH 4M.
Nghiêm cứu khác của Synowiecki và Al-Khateeb, 2001 [24] cho rằng enzyme tốt nhất cho việc phân tách carotenoprotein là trypsin. Phƣơng pháp enzyme lấy đi khoảng 90% protein và carotenoid từ phế liệu quá trình chế biến tơm. Protease nội tại thích ứng với nhiệt độ thấp rất hữu ích cho quá trình xử lý vỏ phế liệu giáp xác, phƣơng pháp dựa trên việc kiểm sốt tự dộng sự phân giải protein. Sản phẩm thu đƣợc cĩ chứa khoảng 4,5% carotenoid, đây cũng là nguồn hợp chất tốt để tạo màu đẹp cho cá hồi và lịng đỏ trứng gà. Việc xử lí sơ bộ phế liệu giáp xác bằng enzyme protease thƣơng mại cịn tăng hàm lƣợng carotenoid khoảng 58%.
Rupsankar Chakrabarti (2002) 25 cho biết khi trích ly carotenoprotein từ phế liệu tơm Metapenaeus monoceros bằng trypsin cho hiệu suất thu hồi sắc tố carotenoid là cao nhất 55%, pepsin và papain là 50% trong 4 giờ ở nhiệt độ 28±5oC, hàm lƣợng protein trong bột protein là 450g/kg.
Mizani và cộng sự (2005) 20 đã nghiên cứu thuỷ phân phế liệu đầu tơm
P.semisulcatus bằng enzym thƣơng mại Alcalase. Để cải thiện hiệu quả trích ly, một vài chất hố học nhƣ sodium sulphite và Triton x-100 đƣợc sử dụng kết hợp với enzym. Khi Alcalase sử dụng độc lập (12 AU/kg), hiệu suất trích ly protein 45,1%, nhƣng khi xử lí kết hợp với Triton x-100 (0.01 g/kg) thì hiệu suất thu hồi protein giảm xuống 39%, trong khi bổ sung sodium sulphite (200mmol/lit) cùng với enzym hay hỗn hợp enzym và Triton x-100 tăng mức trích ly protein từ 62% và 65,1% tƣơng ứng. Protein kết tủa tại pH 3,1 thì hàm lƣợng sulphite trong bột protein giảm 97% và bột protein thu đƣợc cĩ chứa đầu đủ amino acid thiết yếu thích hợp làm thức ăn chăn nuơi.
Holanda và Netto, 2006 [17] nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tơm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzym Alcalase và pancreatin. Theo tác giả trong phế liệu tơm Xiphonpenaeus kroyeri cĩ chứa 39,42% protein, 31,98% tro và 19,92% chitin. Tiến hành thuỷ phân khử protein bằng enzym
Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzym/nguyên liệu (E/S) 3%, nhiệt độ 60oC, pH 8,5. Kết quả nhận thấy rằng Alcalase cĩ hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin, chitin cao hơn so với trypsin, chymotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi protein từ 57,5% lên 64,6% và astaxanthin từ 4,7 lên 5,7 mg/100g phế liệu khơ.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thuỷ, 2006 [8] nghiên cứu nuơi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein ra khỏi vỏ của phế liệu tơm. Sau 24 giờ phần trăm protein cịn lại trong nguyên liệu tơm so với mẫu chƣa xử lí là 12,99%.
Bùi văn Tú, 2006 [13] nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để tách protein từ vỏ tơm trong cơng nghệ sản xuất chitosan. Tác giả đã xác định đƣợc chế độ lên men tối ƣu khi sử dụng hai chủng Lactobacillus plantarum và chủng lactic phân lập từ vỏ tơm và tỉ lệ vi khuẩn so với nguyên liệu là 15/100 (v/w), tỉ lệ rỉ đƣờng/nguyên liệu là 15/100 (w/w), thời gian lên men là 8 ngày. Ở chế độ lên men tối ƣu hàm lƣợng khống và protein khử đƣợc khi sử dụng hai chủng L. plantarum và chủng lactic phân lập từ vỏ tơm lần lƣợt là 41,2%, 40,0% và 60,1%, 61,0%.
Đặng Thị Hiền (2008) [5] đã sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tơm và tận thu protein, asthaxanthin trong cơng nghệ sản xuất chitin – chitosan. Quá trình đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 54oC, 8 giờ, tỉ lệ enzyme bổ sung 0,22%, pH 8, tỷ lệ nƣớc/ nguyên liệu là 1/1. Kết quả thu đƣợc 52,7% protein.
Kết quả của các nghiên cứu cho thấy dùng enzym protease thuỷ phân protein cho kết quả cao về khả năng thu hồi protein và chitin. Nhiều loại enzym protease cĩ thể đƣợc sử dụng vào mục đích này. Tuy nhiên chi phí để mua các loại enzym này khơng phải là nhỏ do đĩ nếu tận dụng đƣợc chính hệ enzym nội tại trên đầu tơm thì sẽ là một lợi thế rất lớn để áp dụng phƣơng pháp này vào quy mơ sản xuất lớn. Nĩ sẽ giúp thu hồi đƣợc protein và chitin cĩ chất lƣợng cao, đặc biệt là gĩp phần giảm thiểu ơ nhiễm mơi trƣờng.
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU