Mục đích: Các công nhân đi lấy mẫu phải đảm bảo vệ sinh, áp dụng cho nhân viên phụ trách công việc lấy mẫu tại phòng đánh giá tinh bột.
Các bước chuẩn bị thao tác đi lấy mẫu
- Đầu đội nón chùm kín tóc, mang khẩu trang, mang ủng. - Vệ sinh tay và muỗng lấy mẫu.
- Rửa tay và muỗng lấy mẫu với nước, xà phòng - Rửa sạch xà phòng
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 38 SVTH: Quách Thị Hương - Thổi bụi trước khi vào phòng đóng gói
- Lấy mẫu phân tích chỉ tiêu thoonh thường thì chứa vào các hũ nhựa.
- Lấy mẫu kiểm tra vi sinh thì đựng vào tíu nylon có kệp miệng (mỗi mẫu lấy ít nhất 3 mẫu đầu, giữa, cuối)
- Lấy mẫu đại diện cho khách hàng chứa vào lylon có kẹp miệng đồng thời phải ép nhiệt ở cả 2 lớp bao (trước khi kẹp túi đựng mẫu không được có vật lạ)
5.13. Kiểm nghiệm hàm lƣợng Nito tổng bằng phƣơng pháp KJELDAHL
Mục đích: xác định hàm lượng nito có trong mẫu để biết được hàm lượng nito tổng được chính xác. Dụng cụ bao gồm: - Buret chuẩn độ 25ml; - Cân điện tử 0,1g; - Pipet 5ml, 10ml, 25ml; - Bếp điện; - Bình tam giác 250ml;
- Bình thủy giải hình cầu 500ml;
- Thiết bị chưng cất buchi B324 Distillation unit - Hệ thống ngưng tụ;
Thuyết minh
- Mấu được bơm vào phễu A (có van A); - Bình giảm áp có van B;
- Bình phản ứng; - ống làm lạnh;
- Bình thu hồi tam giác 250ml;
- Bình chứa nước cất đun sôi có chứa khóa F - Bình thủy giải hình cầu 500ml;
Hóa chất:
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 39 SVTH: Quách Thị Hương - H₂SO₄ nồng độ min 95% 20ml;
- Dung dịch tiêu chuẩn NaOH 0,05N
Cân 20g NaOH rắn hòa tan trong nước định mức lên 10 lít.
- Xác định hệ số F của dung dịch NaOH 0,05N, cho khoảng 0,25000 – 0,3000000 C₈H₅KO₄ đã sấy ở nhiệt độ 105°C trong 2 giờ, thêm 50ml nước cất, lắc cho tan hết thêm vào 3 giọt chỉ thị phenol phtalein, đem chuản độ bằng dung dịch NaOH 0,05N đến mất mầu hồng thì ngưng, đọc thể tích NaOH tiêu hao.
Cách tính
Trong đó:
m khối lượng phân tử của dung dịch C₈H₅KO₄ v thể tích tiêu hao của dung dịch NaOH
- Dung dịch H₂SO₄ 0,05N
Cân 25g H₂SO₄ 97% hòa tan trong nước cất định mức lên 10 lít. - Dung dịch chỉ thị methyl red và methyl blue
- Dung dịch NaOH 30% - 32% - Dung dịch chỉ thi phenol phtalein
Cân 1g phenol phtalein hòa tan trong ethanol min 90% và định mức lên 100ml
Các bước kiểm nghiệm:
Phân giải mẫu:
- Cân 2g qui khô mẫu tinh bột thành phẩm cho vào bình phân giải hoặc mẫu dạng lỏng cân khoảng 3- 20g
- Cho vào 20 ml H₂SO₄ nồng độ min 95%.
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 40 SVTH: Quách Thị Hương - Lấy dung dịch nóng từ bếp điện xuống, làm nguội ở nhiệt độ phòng, định mức lên 100ml.
Chưng cất bằng thiết bị Buchi B – 324 Distillation unit,
- Cho 25ml mẫu đã pha loãng vào ống chưng cất cho vào ống 20ml NaOH 30± 32% (thể tích NaOH cài trên máy chưng cất).
- Cho vào 20 ml H₂SO₄ 0,05N vào bình tam giác 250ml thêm vào vài giọt chỉ thị methyl red – methyl blue đem đặt phía dưới ống dẫn khí của thiết bị (đầu ống nghiệm ngập trong dung dịch H₂SO₄ 0,05N.
- Nhấn nút start máy bắt đầu chưng cất (chưng cất 5 phút) khi kết thúc kêu tictictic.
Chưng cất
- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05N nhỏ giọt đến khi xuất hiện màu xanh
- Ghi lại số ml dùng để chuẩn độ mẫu. - Hút 20ml H₂SO₄ 0,05N
- Để làm mẫu trắng cho vào bình tam giác 250ml, cho 2 – 3 giọt chỉ thi methyl red – methyl blue
- Dùng dung dịc NaOH 0,05N chuẩn độ cho tới khi xuất hiện màu xanh - Ghi lại số ml dùng để chuẩn độ mẫu trắng.
Phương trình phản ứng
- Vô cơ hóa mẫu: 2H2SO4 → 2H2O + 2SO2↑ + O2 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Chưng cất:
- Đuổi dung dịch NH3 bằng dung dịch NaOH
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3↑
- NH3 bay ra cùng với nước biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng (bình hứng chứa H2SO4).
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 41 SVTH: Quách Thị Hương 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O +
H2SO4dư - Chuẩn độ H2SO4 dư:
H2SO4dư + NaOH → Na2SO4 + H2O
Cách tính %TN %protein = %TN 6,25 Trong đó: A số ml chuẩn mẫu trắng; B số ml chuẩn mẫu thử; BSL bội số loãng; m khối lượng mẫu (g);
Lưu ý:
- Lúc gia nhiệt để phân giải cần làm việc nơi thông gió. - Khi thay đổi hóa chất chuẩn độ lại mẫu trắng
- Kiểm tra nguồn điện, nước làm mát máy.
- Buchi B324 thường xuyên kiểm tra bình chưa NaOH 30% và bình chứa H₂SO₄.
5.14. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro tổng
Mục đích: Kiểm tra hàm lượng tro với các dạng phân bón hữu cơ, khoáng vedagro dạng viên, phân NPK, tinh bột….
Dụng cụ bao gồm: - Cân điện tử 0, 0001g - Cốc nung; - Bếp điện; - Tủ hút ẩm; - Lò nung;
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 42 SVTH: Quách Thị Hương - Kẹp lọc;
- Giấy lọc không tro;
Các bước tiến hành:
- Cốc nung được nung ở 500°C ± 550°C đến khối lượng không đổi sau đó lấy ra để nguội trong tủ hút ẩm 30 phút, cân ghi lại khối lượng (m₁).
- Cân 2g tinh bột của các mẫu yêu cầu kiểm tra, ghi lại khơi lượng (m) cho mẫu vào cốc nung.
- Than hóa trên bếp điện, sau khi than hóa hoàn toàn lấy ra để nguội.
- Cho vào lò nung ở 500°C ±550°C nung đến khi phần cặn còn lại tro hóa hoàn toàn.
- Lấy ra để nguội trong tủ hút ẩm 30 phút cân ghi lại khối lượng (m₂).
Chú ý:
- Nếu mẫu không cháy hết cacbon làm ướt bằng nước nóng và lọc bằng giấy lọc không tro, giữ lại phần dịch lọc
- Đem giấy lọc với phần cặn thu được than hóa trên bếp điện, sau đó cho vào lò nung, nung đến khi tro hóa hoàn toàn
- Tiếp tục cho dịch lọc vào cốc nung đem cho bay hơi hết và nung đến tro trắng.
- Nếu mẫu không trắng hoàn toàn được để nguội thêm vào 15ml ethanol, nghiền tro bằng đũa thủy tinh, đến cho bay hơi hết ethanol và nung đến trắng hoàn toàn.
Tính toán hàm lượng tro tổng: Ash %
Trong đó:
m₁ khối lượng cốc nung; m khối lượng mẫu;
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 43 SVTH: Quách Thị Hương
5.15. Phƣơng pháp kiểm tra vi khuẩn chịu nhiệt
Mục đích: Kiểm tra khuẩn chịu nhiệt trong sản phẩm tinh bột biến tính, mẫu MSG và các mẫu theo yêu cầu.
Dụng cụ bao gồm:
- Pipet vô trùng 1ml có chia vạch; - Đĩa petri đường kính Ф 90mm; - Ống nghiệm 10ml có chia vạch; - Muỗng cân;
Lưu ý: Tất cả các dụng cụ đều được vô trùng
- Đèn cồn; - Tủ cấy;
- Tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ 55°C ±1°C; - Bồn nước gia nhiệt duy trì nhiệt độ 70 - 100°C; - Đồng hồ bấm thời gian;
- Máy đếm khuẩn lạc có đèn chiếu sáng thích hợp và buồng đếm màu tối có vạch kẻ ô;
- Cân kỹ thuật 0,01g.
Môi trường thuốc thử:
- HCl 1M cho 8,5ml HCl 37% vào bình định mức chứa sẵn ít nước cất và định lên 100ml.
- NaOH 1M cân 4g NaOH cho vào nước cất hòa tan định mức lên 100ml.
Môi trường B
- Pepton 5.5g; Yeast extract 8.25g; NaCl 2-5g; Agar 10g
Cách pha: cho pepton, Yeast extract, NaCl vào cốc hòa tan bằng nước cất, chỉnh pH 7,2 ± 7,4 và cho them nước đến 500ml, lấy 2/3 môi trường này cho vào nồi inox đun cho đến khi bắt đầu sôi, 1/3 môi trường còn lại vào sau, sau đó cho từ từ agar vào, vừa cho vừa khuấy đều, đun đến cho sôi rót môi trường vào bình tam giác 500ml và tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 30 phút.
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 44 SVTH: Quách Thị Hương
Đệm photphat
- Cân 34g KH₂PO₄ hòa tan trong 500ml nước cất chỉnh về pH 7,2 bằng NaOH 1M, định mức bằng nước cất đến 1000ml, tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút, bảo quản trong tủ lạnh.
Nước pha loãng
- Lấy 125ml dung dịch đệm photphat cho thêm nước cất đến 1000ml, phân phối vào các bình thủy tinh ống nghiệm tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút.
Cách tiến hành:
- Đối với mẫu MSG cân 10g mẫu hòa tan trong 90ml nước pha loãng, đòng nhất mẫu trong khoảng 2 phút, hút 5ml vào ống nghiệm đậy nắp, đem gia nhiệt trong 100°C trong 10 phút.
- Đối với mẫu tinh bột biến tính và các mẫu khác can 10g mẫu thêm vào 40ml nước pha loãng, lắc đều và hút 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước pha loãng, sau đó đem gia nhiệt 80°C trong 30 phút, tùy thuộc vào yêu cầu của khách hàng.
- Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu đem gia nhiệt ở bước trên cho vào đĩa petri, mỗi mẫu cấy 2 đĩa.
- Rót khoảng 15 ± 20ml môi trường B duy trì ở nhiệt độ 42 ± 45°C vào đĩa lắc đều đợi khô, lật úp đĩa và nuôi ở 55°C trong 48h
- Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa.
Kết quả tổng khuẩn chịu nhiệt: Cfu/g
Trong đó :
BSL bội số loãng; V thể tích mẫu cấy;
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 45 SVTH: Quách Thị Hương
5.16. Phƣơng pháp kiểm tra nấm men nấm mốc
Mục đích: Kiểm tra nấm men nấm mốc trong sản phẩm: Nguyên liệu nhập, nguyên liệu sản xuất, đồ uống không cồn, và các mẫu theo yêu cầu.
Dụng cụ bao gồm:
- Pipet vô trùng 1ml có vạch chia; - Đĩa petri đườn kính 90mm; - Bình tam giác 250ml, 500ml; - Ống nghiệm 10ml có nắp đậy; - Muỗng cân;
Lưu ý: Tất cả đều phải được vô trùng
- Đèn cồn; - Tủ cấy;
- Tủ ấm 35°C ± 1°C; - Nồi hấp tiệt trùng;
- Máy đếm khuẩn lạc có đèn chiếu sáng thích hợp và buồng đếm màu tối có vạch kẻ ô;
- Cân kỹ thuật 0,01g. - Máy lọc 0,45µm.
Môi trường thuốc thử:
- HCl 1M cho 8,5ml HCl 37% vào bình định mức chứa sẵn ít nước cất và định lên 100ml.
- NaOH 1M cân 4g NaOH cho vào nước cất hòa tan định mức lên 100ml.
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
- Cân 39g môi trường PDA hòa tan bằng nước cất định mức lên 1000ml, chỉnh pH bằng NaOH hoặc HCl 1M sao cho khi tiệt trung pH là 5,6 ± 0,2, sau đó rót vào bình tam giác 500ml tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút.
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 46 SVTH: Quách Thị Hương - Cân 10g acid tartaric hòa tan bằng nước cất và định mức lên 100ml tiệt trùng qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45µm.
Nước pha loãng
- Lấy 125ml dung dịch đệm photphat cho thêm nước cất đến 1000ml, phân phối vào các bình thủy tinh ống nghiệm tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút.
Cách tiến hành:
- Môi trường PDA đã tiệt trùng làm nguội khoảng 42 ± 45°C cho thêm dung dịch acid tartaric 10% sao cho pH cuối cùng của môi trường là 3,5 ± 0,1(10ml acid tartaric 10% trong khoảng 1000ml môi trường PDA) xoay nhẹ cho đều rót khoảng 15 ± 20ml môi trường vào các đĩa petri, để nguội cho đông đặc dưới điều kiện vô trùng.
- Cân 10g mẫu thêm vào 90ml nước nước pha loãng đồng nhất trong khoảng 2 phút, tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng cách hút 1ml ở mẫu nồng độ trước vào ống nghiệm chứa 9ml nước pepton, lắc đều 1ml mẫu cấy vào đĩa petri mỗi mẫu cấy 2 đĩa
- Tráng đều phơi khô, đậy nắp lật úp đĩa và nôi trong tủ ấm 35°Ctrong 48h giờ.
Tính toán kết quả tổng số nấm men nấm mốc: Cfu/g
Trong đó :
BSL bội số loãng; V thể tích mẫu cấy;
5.16. Phƣơng pháp kiểm tra tổng khuẩn
Mục đích: Kiểm tra tổng khuẩn trong mẫu tinh bột
Dụng cụ bao gồm; - Máy đo pH;
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 47 SVTH: Quách Thị Hương - Ống đong 100ml, 250ml vô trùng;
- Nồi hấp tiệt trùng; - Tủ cấy;
- Cân kỹ thuật 0,01g;
- Que cấy bằng thép không gỉ;
Môi trường và thuốc thử:
- HCl 1M cho 8,5ml HCl 37% vào bình định mức chứa sẵn ít nước cất và định lên 100ml.
- NaOH 1M cân 4g NaOH cho vào nước cất hòa tan định mức lên 100ml.
Plate Caut Agar (PCA)
- Cân 22,5g môi trường PCA hòa tan bằng nước cất định mức lên 1000ml, chỉnh pH bằng NaOH hoặc HCl 1M sao cho khi tiệt trùng pH là 7,02 ± 0,2, sau đó rót vào bình tam giác 500ml tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút.
Đệm photphat
- Cân 34g KH₂PO₄ hòa tan trong 500ml nước cất chỉnh về pH 7,2 bằng NaOH 1M, định mức bằng nước cất đến 1000ml, tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút, bảo quản trong tủ lạnh.
Nước pha loãng
- Lấy 2,5ml dung dịch đệm photphat cho thêm nước cất đến 2000ml, phân phối vào các bình 90ml, 1000ml, tiệt trùng nồi hấp ở 121°C thời gian 15 phút.
Cách tiến hành:
- Cân 25g mẫu vào bình thủy tinh vô trùng, thêm 225ml nước pha loãng sau đó dồng nhất mẫu trong khoảng 2 phút, được nồng độ pha loãng 10ˉ¹
- Dùng pipet vô trùng lấy 10ml dung dịch nồng độ 10ˉ¹ cho vào bình có sẵn 90ml nước pha loãng, tránh bọt khí lắc đều hỗn hợp 25 lần theo hình vòng cung 30cm trong 7s được nồng độ pha loãng 10ˉ²
- Tiếp tục pha loãng với tương tự nồng độ như trên đến nồng độ thích hợp sao cho số khuẩn lạc trong đĩa từ 25 ± 250cfu
GVHD: Th.S Chu Thị Hà 48 SVTH: Quách Thị Hương
Nuôi cấy
- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng nồng độ thích hợp vào đĩa petri mỗi nồng độ cấy 2 đĩa.
- Rót 12 ± 15ml môi trường bằng cách xoay vòng và chuyển động tới lui đĩa petri trên bề mặt phẳng, để cho môi trường đông lại, ghi thông tin mẫu lên đĩa, lật ngược đĩa, đem nuôi tủ ấm 35°C trong 48h.
Mẫu đối chứng dương:
- Lấy 1ml dung dịch canh khuẩn đã pha loãng ở nồng độ khoảng 10²cfu/ml. Mỗi ngày phân tích thực hiện 1 mẫu.
Mẫu đối chứng âm:
- Lấy 1ml dung dịch mẫu bằng nước pha loãng, mỗi ngày phân tích thực hiện 1 mẫu.
Chú ý:
- Thời gian lúc pha loãng nồng độ đầu đến lúc rót môi trường đĩa mẫu cuối cùng không được quá 15 phút.
- Lắc lại bình mẫu đã pha loãng 25 lần theo hình vòng cung 30cm trong vòng 7s nếu để mẫu quá 3 phút trước khi cấy vào đĩa petri.
- Môi trường trước khi sử dụng phải được ổn định nhiệt độ trong bể đều nhiệt ở 45±0,1°C.
- Không được chồng đĩa lên nhau khi rót agar và khi agar đang đông đặc. Tính toán kết quả và báo cáo kết quả.
- Báo cáo kết quả chỉ với 2 con số nghĩa đầu tiên, làm tròn con số thứ 2 lên con số cao nhất và song song nghĩa khi chuyển sang tổng số sinh khuẩn khi số