1.4.1. Nghiờn cứu trờn th giới
Ở cỏc nƣớc phỏt triển, cỏc nghiờn cứu tập trung vào phỏt triển những hƣớng điều trị tớch cực để cải thiện chất lƣợng cuộc sống của bệnh nhõn. Sự phỏt triển của cỏc chế phẩm hiện nay cho phộp bệnh nhõn hemophilia cú cuộc sống nhƣ ngƣời bỡnh thƣờng và tiến tới cú thể chữa khỏi hoàn toàn. Vấn đề chớnh hiện nay ở bệnh ƣa chảy mỏu là sự khởi đầu của cỏc khỏng thể bất hoạt cỏc yếu tố đụng mỏu, mặc dự cỏc chất ức chế miễn dịch cũng đƣợc tiờm cựng trong quỏ trỡnh truyền bổ xung cỏc yếu tố đụng mỏu cú thể loại trừ cỏc chất ức chế trong khoảng hai phần ba số bệnh nhõn. Cỏc chất ức chế này làm cho liệu phỏp điều trị thay thế kộm hiệu quả, hạn chế đỏp ứng điều trị trờn bệnh nhõn và làm tăng nguy cơ mắc bệnh và tử vong [87].
Trong thập kỷ qua mục tiờu cuối cựng của cỏc nhà nghiờn cứu là tỡm kiếm phƣơng phỏp cú thể điều trị dứt điểm bệnh ƣa chảy mỏu. Phƣơng phỏp điều trị gen đó đƣợc nghiờn cứu thụng qua quỏ trỡnh chuyển đoạn DNA mó húa đoạn gen FVIII vào cơ thể ngƣời bệnh. Ngoài ra, một thỏch thức lớn của cỏc phỏc đồ điều trị hiện nay là thời gian bỏn hủy ngắn làm cho nhu cầu tiờm tĩnh mạch thƣờng xuyờn. Do đú khuyến khớch những nỗ lực hơn nữa trong việc sản xuất cỏc yếu tố đụng mỏu cú sinh khả dụng kộo dài hơn. Cỏc chế phẩm đang
nghiờn cứu và thực nghiệm lõm sàng trƣớc khi đƣa vào sử dụng nhƣ: Gắn kết gốc PEG (polyethylene glycol) là một chế phẩm mới cú khả năng kộo dài thời gian bỏn hủy của sản phẩm protein [88]. Hợp nhất Fc cú chức năng bảo vệ IgG và albumin từ quỏ trỡnh dị húa, làm trung gian vận chuyển IgG trờn tế bào biểu mụ [89]. Cỏc thụ thể này cú khả năng kộo dài thời gian bỏn hủy của IgG và albumin đó định hƣớng cho cỏc phƣơng phỏp điều trị mới. Hợp nhất Albumin cú chu kỳ bỏn ró khoảng 20 giờ, sử dụng albumin thƣờng khụng xuất hiện miễn dịch, do đú nú đƣợc sử dụng nhƣ một sản phẩm an toàn. Đõy là sản phẩm đƣợc lựa chọn để kộo dài thời gian bỏn hủy bằng cỏch kết hợp cỏc yếu tố đụng mỏu với albumin ngƣời... [90].
Ở những nƣớc đang phỏt triển, để tiếp cận đƣợc cỏc phƣơng phỏp điều trị mới giỳp điều trị cho bệnh nhõn hemophilia A gặp nhiều khú khăn do kinh phớ điều trị khỏ tốn kộm. Sự ra đời và phỏt triển của sinh học phõn tử giỳp phỏt hiện ra cỏc dạng, cỏc vị trớ đột biến trờn gen F8 gõy bệnh hemophilia A. Hiện nay, hàng năm cú rất nhiều đột biến mới đƣợc cụng bố trờn cơ sở dữ liệu HAMSTeRS (Hemophilia A Mutation, Search, Test and Resource Site) là trang quản lý thụng tin về bệnh hemophilia A của nƣớc Anh: đến thỏng 1/2013 đó cú 2158 đột biến ở cỏc vị trớ khỏc nhau trờn gen F8 đƣợc cụng bố [42]; hay trờn cơ sở dữ liệu của CDC (The Centers for Disease Control and Prevention) là trung tõm kiểm soỏt và phũng chống bệnh dịch của Hoa Kỳ cụng bố về bệnh hemophilia A cú tổng số 2556 vị trớ đột biến gõy bệnh [91].
Cỏc nghiờn cứu về đột biến trờn gen F8 gần đõy ngoài bỏo cỏo cỏc dạng đột biến mới chƣa đƣợc cụng bố cũn phõn tớch đỏnh giỏ cỏc nguy cơ phỏt triển chất ức chế FVIII. Theo nghiờn cứu của tỏc giả Nair năm 2010, khi nghiờn cứu phỏt hiện đột biến trờn gen FVIII đó cụng bố 11 đột biến mới [92]. Cũn theo nghiờn cứu của Reiter cũng trong năm 2010, khi nghiờn cứu trờn 69 bệnh nhõn
hemophilia A thể nặng ở Australia đó cụng bố 38 vị trớ đột biến mới và đỏnh giỏ mối liờn quan vị trớ đột biến với sự phỏt triển yếu tố ức chế FVIII [93].
Trong nghiờn cứu của Samatha và cộng sự năm 2012 trờn 5.383 bệnh nhõn hemophilia A thể nặng trong đú 1.209 bệnh nhõn cú chất ức chế FVIII trong mỏu. Nghiờn cứu sử dụng cỏc thuật toỏn thống kờ tớnh toỏn tỉ lệ nguy cơ phỏt triển chất ức chế ở cỏc dạng, cỏc vị trớ đột biến trờn gen F8 [94].
Trong nghiờn cứu của Schwaab năm 2013 trờn 1.135 bệnh nhõn hemophilia A đó phỏt hiện 195 đột biến mới chƣa đƣợc cụng bố trờn cơ sở dữ liệu HAMSTeRS. Nghiờn cứu này cũn đỏnh giỏ nguy cơ phỏt triển chất ức chế, so sỏnh giữa nhúm đột biến ở vựng C1/C2 với cỏc vựng cũn lại [95].
Ngoài ra, từ cỏc vị trớ đột biến cú thể phỏt hiện ngƣời lành mang gen bệnh trờn cỏc thành viờn nữ trong gia đỡnh ngƣời bệnh và cỏc đối tƣợng liờn quan. Với những thành viờn nữ mang gen cần sớm đƣa ra lời khuyờn di truyền trƣớc khi kết hụn để họ tăng cƣờng nhận thức, làm giảm tỷ lệ mang thai và tỷ lệ trẻ sinh ra bị mắc bệnh hemophilia A, tăng hiệu quả trong việc phũng ngừa bệnh tật đồng thời nõng cao chất lƣợng chăm súc sức khỏe cho cộng đồng xó hội. Ngoài ra, việc phỏt hiện vị trớ, dạng đột biến cũn cú ý nghĩa lớn trong việc lựa chọn phƣơng phỏp điều trị phự hợp ngay từ khi bắt đầu đối với những bệnh nhõn cú nguy cơ cao cú khỏng thể khỏng FVIII.
1.4.2. Nghiờn cứu tại Việt Nam
Cỏc nghiờn cứu tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào cỏc biểu hiện lõm sàng, cận lõm sàng và đỏnh giỏ hiệu quả điều trị của một số chế phẩm thay thế FVIII.
Năm 1991, Bạch Quốc Tuyờn nghiờn cứu đề tài “Nhõn một trƣờng hợp hemophilia A cú khỏng thể khỏng FVIII- Bàn về: vấn đề khỏng thể khỏng đụng lƣu hành”. Đề tài mụ tả một trƣờng hợp cú khỏng thể khỏng
FVIII trong quỏ trỡnh điều trị và bƣớc đầu nghiờn cứu về sự hỡnh thành khỏng thể khỏng FVIII [12].
Năm 1993, Tỏc giả Trần Ngọc Trõn nghiờn cứu điều chế và sử dụng tủa lạnh giàu yếu tố VIII trong điều trị bệnh hemophilia A. Đõy là giai đoạn phỏt triển của quỏ trỡnh điều trị tại Việt Nam khi cú thể tự điều chế chế phẩm điều trị thay thế cú nồng độ FVIII cao hơn và an toàn hơn [96].
Nguyễn Thị Hƣơng Quế cú đề cập tới những tỏc dụng khụng mong muốn ở bệnh nhõn hemophilia ngƣời lớn đƣợc truyền cỏc chế phẩm mỏu từ năm 2004 đến 2008 [7]. Cú một số đề tài nghiờn cứu cỏc lĩnh vực khỏc của hemophilia nhƣ tổn thƣơng khớp, đỏnh giỏ hiểu biết của ngƣời nhà bệnh nhõn về bệnh hemophilia.
Năm 2008, trong những nghiờn cứu tiờn phong về bệnh hemophilia A ở mức độ phõn tử nhúm nghiờn cứu tại Trung tõm Nghiờn cứu Gen-Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội đó thành cụng trong việc tỏch dũng gen mó húa yếu tố VIII của ngƣời bỡnh thƣờng. Đồng thời, nhúm nghiờn cứu cũng đó thành cụng trong việc tạo ra FVIII bị xúa vựng gen B và vẫn giữ nguyờn hoạt tớnh. Nhúm nghiờn cứu đó thiết kế vector, biểu hiện và tinh chế thành cụng FVIII ngƣời trờn đối tƣợng E.coli, vector thuộc hệ retrovirus mang gen mó FVIII tỏi tổ hợp cũng đó đƣợc thiết kế thành cụng mở đƣờng cho cỏc nghiờn cứu ứng dụng liệu phỏp điều trị gen sau này ở Việt Nam [97].
Hiện nay, nghiờn cứu xỏc đột biến gõy bệnh hemophilia A tại Việt Nam là rất ớt. Viện Huyết học truyền mỏu, trong một đề tài cấp Bộ y tế đang nghiờn cứu xỏc định đảo đoạn intron 22 và intron 1 trờn bệnh nhõn hemophilia A. Tuy nhiờn, nghiờn cứu này sử dụng phƣơng phỏp LD-PCR để xỏc định đột
biến đảo đoạn intron 22, phƣơng phỏp này khú thực hiện, thời gian điện di lõu. Nghiờn cứu này cũng chỉ tập trung sàng lọc nhúm bệnh nhõn thể nặng, khoảng 50% bệnh nhõn khụng cú đột biến đảo đoạn intron sẽ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến.
Trong nghiờn cứu của Phạm Quang Vinh và cộng sự, bƣớc đầu đó ứng dụng phƣơng phỏp PCR-RFLP với vị trớ cắt của enzym BclI tại intron 18 để chẩn đoỏn ngƣời mang gen bệnh trong gia đỡnh bệnh nhõn hemophilia A. Phƣơng phỏp này dựa trờn cơ sở cú nhiều đột biến DNA trờn gen F8 khụng gõy bệnh, những đột biến này là cỏc chỉ điểm để phỏt hiện cỏc trƣờng hợp mang gen bệnh. Tuy nhiờn đõy cũng chỉ là phƣơng phỏp phỏt hiện giỏn tiếp, khụng phỏt hiện đƣợc vị trớ đột biến thực sự gõy bệnh hemophilia A [98].
1.5. NHỮNG VẤN ĐỀ CếN TỒN TẠI
Khụng cú kỹ thuật sinh học phõn tử nào cú thể xỏc định đột biến ở 100% bệnh nhõn hemophilia A. Một số đột biến nằm trong gen F8 khụng phõn tớch đƣợc bằng những kỹ thuật phõn tớch đột biến hiện nay. Phƣơng phỏp giải trỡnh tự DNA của toàn bộ gen F8, cú thể đƣợc coi là "tiờu chuẩn vàng" để xỏc định cỏc đột biến điểm vẫn khụng thể phỏt hiện đột biến trong mọi trƣờng hợp. Theo nghiờn cứu của Goodeve năm 2008, tỉ lệ khụng phỏt hiện đƣợc đột biến chiếm 2-7% tổng số bệnh nhõn hemophilia A [5].
Tại Italy, khi Margaglione và cộng sự nghiờn cứu trờn 1.296 bệnh nhõn hemophilia A, chỉ cú 1.153 trƣờng hợp phỏt hiện đột biến chiếm tỉ lệ 89%. Tỷ lệ này cú thể thay đổi tựy theo tớnh chớnh xỏc trong chẩn đoỏn lõm sàng và hiệu quả phỏt hiện đột biến [51].
Trong nghiờn cứu này, do điều kiện thời gian, trang thiết bị mỏy múc và kinh phớ hạn hẹp chƣa thể phối hợp hết cỏc kĩ thuật sinh học phõn tử hiện đại để chẩn đoỏn đột biến gen F8. Tuy nhiờn, phƣơng phỏp I-PCR phỏt hiện đột biến đảo đoạn intron 22, kết hợp với kĩ thuật giải trỡnh tự toàn bộ 26 exon để phỏt hiện đột biến là phƣơng phỏp mới nhất, thụng dụng nhất để sàng lọc phỏt hiện đột biến ở bệnh nhõn hemophilia A trong giai đoạn hiện nay.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIấN CỨU
- Nhúm đ i chứng: 20 ngƣời (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đỡnh
khụng cú ngƣời mắc bệnh di truyền. Nhúm chứng đƣợc dựng để chuẩn húa kỹ thuật và làm mẫu đối chứng cựng với mẫu nghiờn cứu khi thực hiện cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử để phõn tớch gen.
- Nhúm nghiờn cứu: 103 bệnh nhõn đƣợc chẩn đoỏn xỏc định hemophilia
A tại viện Nhi Trung ƣơng và viện Huyết học truyền mỏu Trung ƣơng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiờu chuẩn chẩn đoỏn hemopphilia A:
+ Lõm sàng:
- Chảy mỏu: Chảy mỏu khú cầm sau chấn thƣơng, va chạm hay chảy mỏu tự nhiờn.
- Vị trớ: Chảy mỏu trong khớp, cơ hoặc một số vị trớ khỏc. - Tớnh chất: Thƣờng chảy mỏu tỏi phỏt.
- Tiền sử: cú tiền sử chảy mỏu kộo dài hoặc trong gia đỡnh cú ngƣời thõn bị chảy mỏu khú cầm.
+ Cận lõm sàng: - APTT kộo dài.
- Định lƣợng FVIII giảm dƣới 30%. - Thời gian mỏu chảy bỡnh thƣờng.
- Số lƣợng tiểu cầu và độ tập trung tiểu cầu bỡnh thƣờng. - Prothrombin bỡnh thƣờng.
- Yếu tố von Willebrand bỡnh thƣờng.
Tiờu chuẩn loại trừ :
+ Bệnh nhõn mắc bệnh Von-Willebrand.
+ Cỏc bệnh lý di truyền gõy kộo dài APTT: giảm yếu tố XI, XII, prekallikrelin.
Tiờu chuẩn xỏc định cú khỏng thể khỏng FVIII:
- Xột nghiệm Mixtest (là xột nghiệm để xỏc định sự cú mặt của chất ức chế): trộn huyết tƣơng bệnh nhõn với huyết tƣơng của ngƣời bỡnh thƣờng với tỷ lệ 1:1 và ủ trong 2 giờ ở 37°C. Đo thời gian APTT của ngƣời bỡnh thƣờng và APTT của mẫu trộn sau 2 giờ. Nếu APTT ở mẫu mỏu trộn kộo dài hơn mẫu ngƣời bỡnh thƣờng là cú khỏng thể trong mỏu bệnh nhõn.
- Xột nghiệm Bethesda (là xột nghiệm đo nồng độ chất ức chế): 1 đơn vị Bethesda là lƣợng khỏng thể cú thể trung hoà 50% của 1 đơn vị FVIII thờm vào ủ trong 2 giờ ở 37 độ C.
Chẩn đoỏn c khỏng thể khỏng VIII: xột nghiệm Mixtest dƣơng tớnh và định
lƣợng cú khỏng thể khỏng VIII bằng xột nghiệm Bethesda.
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HểA CHẤT NGHIấN CỨU
2.2.1. Dụng cụ
- Ống Eppendorf 1,5 mL; 0,5 mL; 0,2 mL
- Ống lấy mỏu chống đụng EDTA
- Mỏy Gene Amp PCR System 9700 (USA)
- Pipet, đầu cụn cỏc loại
- Tủ lạnh sõu: -30°C; -80°C (SANYO) - Mỏy điện di: Mupid (Nhật Bản)
- Mỏy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Mỏy ly tõm lạnh Beckman (USA) và ly tõm để bàn Eppendorf (Đức) - Lũ vi súng
- Mỏy đọc trỡnh tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ)
2.2.2. Hoỏ chất
* Húa chất dựng để tỏch chi t DNA:
- Dung dịch Lysis buffer
- Dung dịch SDS 10% - Dung dịch K (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Proteinase K
- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl (tỷ lệ 25 : 24 : 1) - Dung dịch chloroform: isoamyl ( tỷ lệ 24 : 1)
- Sodium acetate 3M, pH=5,2 - Ethanol 100%; ethanol 70% * Hoỏ chất để thực hiện kỹ thuật PCR
+ Buffer 10x + dNTP 10 mM + Taq polymerase + Cỏc cặp mồi * Hoỏ chất để điện di sản phẩm PCR + Agarose + Dung dịch TBE 10X + Loading buffer 10X + Ethidium bromide * Hoỏ chất để đọc trỡnh tự gen
BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems) gồm BigDye Terminator v3.0 (dATP, dCTP, dGTP và dUTP), BigDye buffer, cặp mồi đặc hiệu, dung dịch formamide.
* Húa chất để tinh sạch DNA
- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1 - Dung dịch chloroform: isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100%; ethanol 70% - Hũa tan bằng nƣớc tinh khiết
* Húa chất để cắt DNA:
+ Enzym BclI + Buffer BclI
* Húa chất để n i DNA:
+ T4 ligate
+ Buffer T4
2.2.3. Trỡnh tự mồi cho cỏc phản ứng PCR
- Trỡnh tự mồi của phản ứng Inversion – PCR xỏc định đột bi n đảo đoạn intron 22 của gen F8 [78]
Tờn mồi Trỡnh tự
ID (mồi xuụi trong gen F8) ACATACGGTTTAGTCACAAGT IU (mồi ngƣợc trong gen F8) CCTTTCAACTCCATCTCCAT ED (mồi xuụi ngoài gen F8) TCCAGTCACTTAGGCTCAG
- Trỡnh tự mồi của phản ứng PCR xỏc định đột bi n đảo đoạn intron 1 của gen F8 [99]
Tờn mồi Trỡnh tự
9F GTTGTTGGGAATGGTTACGG
9cR CTAGCTTGAGCTCCCTGTGG
Int1h-2F GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA
Int1h-2R TGGGTGATATAAGCTGCTGAGCTA
- Trỡnh tự mồi của phản ứng PCR khu ch đại 26 exon của gen F8
Thiết kế 38 cặp mồi riờng biệt để khuếch đại 26 exon David 1994 [100]. Trong đú exon 14 cú kớch thƣớc lớn nhất 3,1 kb nờn cần 9 cặp mồi; exon 26 kớch thƣớc cần 5 cặp mồi để khuếch đại toàn bộ cỏc exon này.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Sơ đồ nghiờn cứu
Cỏc kiểu hỡnh khỏc nhau trờn lõm sàng đƣợc chứng minh là do cỏc dạng đột biến khỏc nhau gõy nờn. Dựa vào đặc điểm này, chỳng tụi thiết kế mụ hỡnh xỏc định đột biến của cỏc thể hemophilia A nhƣ hỡnh 2.1:
- Đối với bệnh nhõn thể nặng, do đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm đa số nờn đầu tiờn cần tiến hành xỏc định hiện tƣợng đảo đoạn intron 22 bằng phƣơng phỏp inversion PCR. Khụng phỏt hiện đƣợc đột biến đảo đoạn intron 22 ta tiến hành tiếp trờn intron 1 bằng phƣơng phỏp multiplexPCR xem cú hiện tƣợng đột biến đảo đoạn intron 1 hay khụng. Nếu vẫn khụng xỏc định đƣợc thỡ ta khuếch đại toàn bộ 26 exon tỡm đột biến mất exon. Nếu cỏc exon đều lờn vạch tƣơng ứng kớch thƣớc DNA ngƣời bỡnh thƣờng thỡ phõn tớch đột biến điểm trờn 26 exon hoặc tại cỏc vị trớ nối bằng phƣơng phỏp giải trỡnh tự. Cỏc vị trớ đột biến xỏc định đƣợc sẽ xõy dựng bản đồ gen F8. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đối với những bệnh nhõn thể vừa và thể nhẹ do khụng bị đột biến đảo đoạn nờn chỉ sử dụng phƣơng phỏp PCR khuếch đại 26 exon tỡm đột biến, nếu khụng cú đột biến mất exon thỡ giải trỡnh tự gen trực tiếp để phỏt hiện cỏc dạng đột biến điểm. Cỏc vị trớ đột biến xỏc định đƣợc sẽ xõy dựng bản đồ gen F8.
2.3.1. Qu trỡnh lấ mẫu
Bệnh nhõn đó chẩn đoỏn hemophilia A đƣợc lấy 5 mL mỏu tĩnh mạch, cho vào ống chống đụng bằng EDTA với hàm lƣợng 1,5 mg/mL. Quy trỡnh lấy mỏu đảm bảo vụ trựng tuyệt đối.
2.3.2. Quy trỡnh tỏch chi t DNA từ mỏu ngoại vi
- Mỏu tƣơi chống đụng EDTA cần tỏch trong vũng 24 giờ.
- Cho 0,5 mL mỏu tƣơi toàn phần chống đụng bằng EDTA vào ống