ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.5. Giải trình tự DNA
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của phương pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy [6].
Nguyên tắc:
DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’-OH của mạch đơn DNA đang tổng hợp, khi gặp các dideoxynucleotide (được đánh dấu huỳnh quang) khơng có nhóm 3’- OH phản ứng tổng hợp sẽ bị dừng lại. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.
Theo nguyên tắc bước đầu tiên trong quy trình thí nghiệm chuẩn để giải trình tự DNA dideoxynucleotide là sự ủ ghép một oligonucletide tổng hợp (dài từ 17 đến 21 nucleotide làm mồi) với một phân đoạn đã xác định của một sợi của vector nhân dịng gần vị trí chèn của DNA nhân dịng. Oligonucleotide
hoạt động như một trình tự mồi bằng cách cung cấp một nhóm 3’ hydroxyl cho sự khởi đầu tổng hợp DNA. Mẫu DNA mồi được chia thành bốn ống nghiệm. Mỗi ống chứa bốn deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), và một trong bốn deoxyribonucleotide được đánh dấu phóng xạ và một trong bốn dideoxynulceotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide trong mỗi ống nghiệm được điều chỉnh thận trọng để đảm bảo sự gắn hỗn hợp các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và khơng gắn ở vị trí đầu tiên của nucleotide bổ trợ của khuôn.
Các phản ứng tổng hợp bị dừng bằng cách bổ sung formamit ngăn không cho các sợi DNA bắt cặp với nhau, và các phân tử DNA mới được tổng hợp được tách nhau bằng điện di trên gel polyacrylamit. Phương pháp phân tách này phân giải các đoạn DNA khác biệt về kích thước ít nhất một nucleotide.