3.1. Phân lập Gene 12S rRNA
3.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số
Sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả này được chúng tơi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.2).Kết quả điện di cho thấy DNA tổng số của tất cả các mẫu nghiên cứu được ly trích khá tốt, DNA đứt gãy ít, khơng tạp nhiễm.
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1%.
H1-H10: các mẫu thu ở Huế , HT: mẫu thu ở Hà Tĩnh
3.1.2. Phân lập gen 12S rRNA
Gen 12S rRNA được phân lập từ DNA tổng số thông qua phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit của
Promega. Phân tích hình ảnh trên gel agarose 1% cho thấy xuất hiện băng đặc hiệu với kích thước khoảng 400 bp. Kích thước này tương đương với vùng peptide hoàn chỉnh của gen 12S rRNA (mã số Genebank AY159059).
Kết quả phân lập gene 12S rRNA của chúng tơi có kích thước tương tự như một số tác giả đã nghiên cứu trước đó. Chẳng hạn như, Patrick Mausfeld và Andreas Schmitz (2003) khi tiến hành nghiên cứu đã nghiên cứu sự đa dạng chủng loại và hình thành lồi của thằn lằn bóng châu Á Eutropis
Fitzinger, 1843 đã thu được gen 12S rRNA kích thước khoảng 408 bp [30],
Carranza và Arnold (2003) nghiên cứu nguồn gốc xuyên đại dương của thằn lằn bóng Mabuya bằng chỉ thị phân tử mtDNA phân lập được gen 12S rRNA có kích thước 379 bp [20].
Hình 3.2. Kết quả phân lập gene 12S rRNA trên gel agarose 1%
H1-H10: các mẫu thu ở Huế, HT: mẫu thu ở Hà Tĩnh, QT: mẫu thu ở Quảng Trị, M: marker HyperLadder TM 100bp , DCA: đối chứng âm
3.2. Tạo dòng gene 12S rRNA
3.2.1. Tạo dòng gene 12S rRNA vào vector pGEM – T – easy và biến nạp vào tế bào E.coli Top 10 nạp vào tế bào E.coli Top 10
Sản phẩm PCR được gắn vào vector pGEM® – T- easy sau đó biến nạp vào tế bào E. coli TOP10. Dung dịch biến nạp được trải lên đĩa chứa mơi trường chọn lọc (LB + agar + 50 µg/mL ampicilin + IPTG 100 mM + X – Gal 20 mg/mL). Kết quả cho thấy có các khuẩn lạc xanh và trắng mọc trên mơi trường chọn lọc ( hình 3.3 ).
Các khuẩn lạc trắng được chọn lọc và xác định sự hiện diện của gene trong các tế bào E. coli TOP10 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene 12S rRNA. Kết quả cho thấy đã xuất hiện băng đặc hiệu đúng với kích thước dự đốn khoảng 408 bp ( hình 3.4 )
Sau khi xác định sự hiện diện của gene 12S rRNA trong tế bào E. coli
TOP10, chúng tôi tiến hành nuôi huyền phù khuẩn lạc được chọn trong mơi trường LB lỏng có chứa 50 µg/mL ampicilin và tiến hành tách chiết plasmid theo kít: PureYeid Plasmid Miniprep System (hãng Promega), sau đó kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp primer 12S rRNA(hình 3.5).
Hình 3.3: Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc
(LB đặc + Ampicillin 50 µg/mL + IPTG 100mM + X – Gal 20mg/mL).
Hình 3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%
H1-H10: các mẫu thu tại Huế, QN1-QN8: các mẫu thu tại Quảng Nam, DN1- DN7: các mẫu thu tại Đà Nẵng, DCD: đối chứng dương, DCA: đối chứng âm
Hình 3.4. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM – T easy – 12S
rRNA trong chủng E. coli TOP10 trên gel agarose 1%. M: Marker ADN
HyperLadderTM 1kb Plus (250 – 12007 bp, hãng BioLine). Sản phẩm plasmid thu được sau khi tách (H1-H10: các mẫu thu tại Huế, DN1-DN8:
các mẫu thu tại Đà Nẵng, NA1: mẫu thu tại Nghệ An,X: plasmid tách từ khuẩn lạc xanh, DCA: đối chứng âm)
3000 bp bp 250 bp 500 bp 3000 bp