3.3.2.1. Phương pháp xác định vật chất khô của nguyên liệu
Chuẩn bị các mẫu thí nghiệm, cân chính xác khối lượng chén và hạt cilicazen, cho vào khoảng 3- 5ml dịch cặn men bia. Cân khối lượng ban đầu, sấy khô đến khối lượng không đổi. Vật chất khô của nguyên liệu được tính như sau:
VCK (%) = (khối lượng mẫu sau sấy / khối lượng mẫu ban đầu) x100 3.3.2.2. Phương pháp thủy phân cặn men bia kiềm, thủy phân bằng phương pháp tự phân tại công ty Cổ Phần môi trường quốc tế Rainbow
Phương pháp thủy phân cặn men bia, xác định quy trình
• Quy trình thủy phân cặn men bia bằng kiềm
• Quy trình thủy phân bằng phương pháp tự phân
Sau khi thủy phân cặn men bia và được phân tích hàm lượng acid amin tổng số bằng máy phân tích acid amin tự động của Mỹ (làm tại phòng phân tích thức ăn chăn nuôi- Viện chăn nuôi).
3.3.2.2.1. Quy trình thủy phân cặn men bia
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình thủy phân cặn men bia
Giải thích quy trình:
xl Cặn men bia vận
chuyển từ nhà máy về
Pha chế theo công thức làm môi trường cấy
giống vi sinh vật Đóng chai bảo quản 200ml, 500ml,1000ml,
20l,
Thủy phân bằng kiềm 22-240C,18-20h
Lên men 80oC, 3 ngày
Bước 1: Cặn men bia được vận chuyển từ nhà máy bia về sau quá trình
nấu bia. Cặn được bảo quản trong các thùng nhựa dung tích 200l. Men bia được nuôi cấy theo nguyên tắc tăng dần thể tích và số lượng để tăng khả năng lên men. Sau đó lên men ở nhiệt độ 800C trong 3 ngày. Quá trình lên men phải bảo quản trong điều kiện thoáng mát, nhiệt độ không quá 100C. Men thải phải vẫn giữ nguyên màu sắc của dịch lên men đầu và chưa có mùi hư hỏng.
Hình 3.2.Thùng chứa cặn men bia dung tích 200 lit
Bước 2: Cặn men ở các thùng lên men chính sau khi đã chuyển dịch vào
lên men phụ chia làm ba lớp.
• Lớp dưới cùng.
• Lớp giữa.
• Lớp trên cùng.
Chỉ lên dùng lớp ở giữa sau khi đã xử lý. Sau đó cặn men bia được cho ra giá lọc nhằm loại bỏ hết nước.
Hình 3.3. Giá lọc nước cho cặn men bia
Bước 3: Sau khi được chuyển về cặn men bia được cho vào máy ly tâm.
Mục đích của quá trình ly tâm nhằm thu xác men bia. Quá trình ly tâm cho nguyên liệu nhằm loại bỏ nước mà giá lọc không thể bỏ hết được. Sau khi ly tâm nguyên liệu ở dạng thô tơi và xốp mịn.
Hình 3.4. Máy ly tâm cặn men bia
Bước 4: Sau quá trình ly tâm thu xác men bia. Ta đưa xác men bia vào
thủy phân bằng kiềm, nhằm mục đích phá hủy thành tế bào nấm men, tạo điều kiện cho protein được chiết xuất ra ngoài môi trường và giảm lượng axit nucleic trong nấm men. Thủy phân bằng NaOH, điều chỉnh tới pH phù hợp, sau đó đưa về nhiệt độ cần thiết (22- 240C) trong thời gian 18- 20 giờ. Trong thời gian tiến hành thủy phân cần thường xuyên khuấy đều nguyên liệu dảm bảo cho quá trình thủy phân diễn ra đồng đều trong cả khối nguyên liệu.
Hình 3.5. Nồi thủy phân cặn men bia
Bước 5: Sản phẩm sau khi tiến hành thủy phân, pH dao động khoảng 10-
11. Do vậy ta phải tiến hành trung hòa bằng axit HCl để đưa pH về dạng trung hòa (6.5- 7) nhằm dảm bảo cho sản phẩm an toàn sử dụng.
Bước 6: Sản phẩm thu được sau quá trình thủy phân ta đem thu lại và
đóng chai 200ml, 500ml, 1000ml, và 20l nếu cần như sử dụng với số lượng nhiều. Sản phẩm được đóng thùng và đem bảo quản và đưa ra thị trường để tiêu thụ.
Hình 3.6. Sản phẩm thu được sau quá trình thủy phân
Quy trình thủy phân cặn men bia tạo môi trường lên men vi sinh vật và tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được tiến hành trên quy mô sản xuất để bán sản phẩm ra thị trường tại Công ty Cổ phần môi trường quốc tế Rainbow (Đông Anh- Hà Nội).
Hình 3.7. Công nhân đóng chai và bảo quản sản phẩm cuối cùng
3.3.2.2.2. Quy trình sản xuất nấm men bằng phương pháp tự phân
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình sản xuất nấm men bằng phương pháp tự phân
Giải thích quy trình
Bước 1: Nguyên liệu nấm men bia phải được tiến hành xử lý ngay khi
vừa tháo khỏi thiết bị chứa đựng. Thời gian dự trữ không quá 3 ngày và phải bảo quản trong điều kiện thoáng mát, nhiệt độ không quá 100C. Men thải phải giữ nguyên màu sắc của dịch lên men đầu và chưa có mùi hư hỏng.
Bước 2: Li tâm làm khô men. Tiến hành li tâm nhằm loại bỏ lượng nước
có trong bã men bia. Li tâm tới khi độ ẩm dưới 40% là đạt yêu cầu. Sau khi li tâm nguyên liệu ở dạng thô tơi và xốp mịn.
Bước 3: Phá hủy thành tế bào. Tế bào nấm men sau khi li tâm đến khi pH
6.5 đến 7.0 dược đưa về nhiệt độ 45- 500C và giữ nguyên nhiệt độ này trong thời gian 16- 18 giờ (trong thời gian xử lý cần thường xuyên khuấy đều bảm bảo cho
xliv Sấy phun Phá hủy thành tế bào Li tâm và làm khô Nấm men bia Sản phẩm
quá trình tự phân diễn ra đều). Sau thời gian trên đưa nguyên liệu về nhiệt độ ổn định trong 2- 4 giờ. Sau đó đem sấy phun sản phẩm.
Bước 4: Sấy phun. Sau khi kết thúc quá trình phá hủy thành tế bào ta tiến
hành sấy phun để thu sản phẩm. Sản phẩm được sấy phun với nhiệt độ 2800C và nhiệt độ đầu ra là 1000C.
Bước 5: Sản phẩm. Sản phẩm sau khi qua quá trình sấy phun có dạng bột,
mịn, không vón cục, màu sáng. Độ ẩm khoảng 4.7%, mùi thơm. Sản phẩm sẽ được pha chế dạng dung dịch và chiết xuất để thành sản phẩm cuối cùng để bán ra thị trường.
Hiện nay quy trình sản xuất nấm men bia bằng phương pháp tự phân đang trong giai đoạn nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm sản xuất và có kết quả rất tốt.
3.3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Nuôi cấy các chủng vi sinh vật trên môi trường thủy phân, đồng thời so sánh với các môi trường hóa học. 4 loại môi trường dịch thể được sử dụng trong nghiên cứu thí nghiệm này:
+ Môi trường Y.M.P (nuôi cấy vi khuẩn lactic)
Cao nấm men 3 g Pepton 5 g
Glucoza 10g Nước cất vừa đủ 1000 ml
+ Môi trường Zapek-Dox (nuôi cấy nấm mốc- Aspergillus niger)
Glucoza 10 g KH2PO4 3 g Citrat natri 5 g MgSO4 0,1 g FeSO4 0,1 g (NH4)2SO4 3 g KCL 1 g K2HPO4 7 g Nước cất vừa đủ 1000ml
+ Môi trường Martin (nuôi cấy nấm men)
Glucoza 10 g Pepton 5 g Cao nấm men 0,5 g Sose bengol 1 g KH2PO4 1 g MgSO4 0,5 g Nước cất vừa đủ 1000ml
+ Môi trường cặn men bia tự thủy phân
Dung dịch men bia tự phân 100g KH2PO4 1 g
Nước cất vừa đủ 1000ml
Tất cả các môi trường trên sau khi pha chế cho 250ml mỗi loại vào 1 bình tam giác riêng rẽ. Vặn kín bằng nút bông, tiến hành khử trùng nhiệt độ 1200C, áp suất 1at trong thời gian 30 phút, để nguội lấy ra buồng vô trùng và cấy giống tương ứng vào mỗi bình. Thao tác này làm trong buồng vô trùng. Lấy ra lắc đều trên máy lắc ổn nhiệt 24 giờ mỗi mẻ. Sau khi nuôi cấy 24-48 giờ (với vi khuẩn) và 72 giờ (với các chủng nấm men và nấm mốc) tiến hành lấy mẫu kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật.
* Phương pháp lên men nuôi cấy vi sinh vật
- Mẫu chứa vi khuẩn lactic được nuôi cấy trên môi trường dịch thể (lỏng)
• Dung tích bình lên men 5 lít.
• Trạng thái nuôi: Nuôi tĩnh hoặc có khuấy sục khí tùy loại VSV
• Thời gian 2 - 4 ngày lấy mẫu ra kiểm tra tế bào vi khuẩn, kiểm tra số lượng tế bào.
+ Phương pháp kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật (CFU) được xác định bằng đếm gián tiếp số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch (đĩa petri) sau đó nhân với hệ số pha loãng.
Công thức:
M (CFU/ml) = A x D /V
Trong đó: A là số khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa D là độ pha loãng
V lượng dung dịch mẫu cho vào đĩa
Sau khi lên men sử dụng dung dịch này để làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm.
+ Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng đo mật độ quang Mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi cấy được đo trên máy so màu quang điện bước sóng 580 nm.
+ Xác định số lượng tế bào vi sinh vật tổng số sau hỗn hợp nuôi cấy 3 chủng.
Thời gian xác định là 15-30-60 ngày. + Phương pháp xác định sinh khối OD.
OD (Optical Density) – là phương pháp dùng để đo nồng độ tế bào có trong dung dịch huyền phù. Phương pháp này có ưu điểm lớn là có thể thực hiện trong thời gian ngắn và không gây phá hủy tế bào.
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng: Khi truyền qua dung dịch huyền phù, ánh sáng sẽ bị tán xạ. Sự tán xạ phụ thuộc vào nồng độ tế bào trong dung dịch huyền phù. Nồng độ tế bào càng cao thì sự tán xạ càng lớn.
Thông thường, để xác định nồng độ tế bào, ta cần phải xác định mật độ quang (OD). Mật độ quang được xác định dựa vào tỷ số giữa cường độ ánh sáng trước khi qua mẫu và sau khi qua mẫu:
Trong đó:
- Aλ là mật độ quang tại bước sóng λ. - I0 là cường độ sáng trước khi qua mẫu. - I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.
Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức sau: [Số tế bào/ml] = A600 x (Hệ số chuyển đổi) x (Hệ số pha loãng)
Hệ số chuyển đổi được mặc định là 5x108.
3.3.2.4 Xác định điều kiện trong quy trình sản xuất các chế phẩm sinh học vi sinh vật đa chủng (dạng bột)
- Thời gian thủy phân môi trường.
- Lượng vi sinh vật bổ sung vào môi trường. - Thời gian, nhiệt độ sấy sản phẩm.
- Đóng gói sản phẩm.
- Theo dõi thời gian bảo quả
Phần IV
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THỦY PHÂN CẶN MEN BIA (CMB) LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Sau khi cặn men bia được thu từ nhà máy về sẽ lên men ở nhiệt độ 80oC trong vòng 3 ngày. Sau đó, men bia được tiến hành ly tâm để thu xác men bia. Xác men bia sẽ được tiến hành thủy phân.
4.1.1. Thủy phân nấm men bia bằng dung dịch kiềm
Kiềm có tác dụng thủy phân phức hệ glucan, protein và lipit gây hư hỏng mạng lưới cấu trúc của thành màng dẫn tới phá vỡ tế bào. Nhờ vậy chất nội bào được tiết ra môi trường dễ dàng. Phương pháp thủy phân thành tế bào nấm men bằng dung dịch kiềm được dùng rộng rãi với quy mô khá lớn để thu hồi. Tuy nhiên quá trình kiềm hóa mạnh có thể cho sản phẩm protein bị biến tính cắt mạch đáng kể nhất là với các sản phẩm không bền ở pH cao.
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của pH tới quá trình thủy phân tế bào nấm men pH dịch nấm
men sau thủy phân
% protein được giải phóng Tỷ lệ nấm men bị phá vỡ thành tế bào(%) 7 0 0 8 32.25 30 9 40.84 65 10 47.28 100 11 47.30 100 12 47.28 100
Nhìn vào bảng trên ta thấy, dịch nấm men được xử lý với pH= 7, 8, 9, 10, 11, 12. Theo bảng 4.1 chúng ta thấy, khi thủy phân dịch nấm men ở pH = 7, 8,
và 9 thì tỷ lệ nấm men bị phá vỡ thành tế bào chỉ đạt 0,30 và 65% tương ứng với % protein giải phóng thấp (0%, 32.25%, và 40.84%). Tuy nhiên khi tăng pH thủy phân đến 10 thì tỷ lệ tế bào nấm men bị phá vỡ là 100% và % protein giải phóng là 47.28%. Tuy nhiên, khi tăng pH đến 11 và 12 lượng protein tăng dần nhưng không đáng kể nhiều (từ 47.28 đến 47.30%). Chính vì vậy ta chọn pH= 10 là pH thích hợp cho quá trình thủy phân tế bào nấm men, bởi với pH> 10 ta phải tiêu tốn thêm lượng NaOH để tăng giá trị pH lên.
Sau khi xác định được pH thích hợp cho quá trình thủy phân thành tế bào nấm men, ta tiếp tục xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân tế bào nấm men
pH xử lý Thời gian xử lý (giờ) % protein được giải phóng Tỷ lệ nấm men bị phá vỡ thành tế bào (%) 0 0 0 10 14 34.54 40 10 16 40.88 65 10 18 47.28 100 10 20 47.30 100 10 22 47.30 100 10 24 47.28 100
Nhìn vào bảng trên ta thấy, ở cùng pH bằng 10 thời gian xử lý của quá trình thủy phân xảy ra là khác nhau. Sau 14 giờ quá trình xảy ra thì lượng nấm men bị phá vỡ thành tế bào đạt 40%, tương ứng với lượng protein được giải phóng ra là 34.54%. Khi thời gian xử lý là 18 giờ lượng nấm men bị phá vỡ thành tế bào đạt mức 100% và lượng protein được giải phóng ra đạt ở mức 47.28%. Sau khoảng thời gian đó đem dịch trong đi phân tích protein ta thấy hàm lượng protein giải phóng ra không đáng kể (47.30%). Do vậy tôi đã chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân thành tế bào là 18 giờ.
Sau khi xác định được thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân ta tiếp tục xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân xảy ra.
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân tế bào nấm men.
Theo kết quả của bảng trên ta thấy, cùng thời gian xử lý (180C) nhưng ở các dải nhiệt độ khác nhau, khi nhiệt độ xử lý là 160C thì tỷ lệ tế bào bị phá vỡ thành tế bào là 40%, tương ứng với lượng protein được giải phóng ra là 36.38%. Khi nhiệt độ được tăng lên đến mức 200C tỷ lệ tế bào được phá vỡ là 100%, ứng với lượng protein được giải phóng ra là 43.85%. Nhiệt độ tiếp tục đưa lên cao hơn 220C, và 24 0C, mặc dù tỷ lệ tế bào được giải phóng là như nhau (100%) nhưng lượng protein giải phóng ra có sự khác chút ít (từ 46.92 đến 47.28%). Tiếp tục tăng nhiệt độ lên 260C, tỷ lệ phá vỡ thành tế bào đạt 100% tuy nhiên thì tỷ lệ protein được giải phóng ra tăng lên là không đáng kể là bao nhiêu (47.30%). Hơn nữa nếu tăng nhiệt độ xử lý lên cao tiếp (trên 260C) khi đó là thời điểm thích hợp cho các enzym nội bào hoạt động, quá trình phân hủy protein được giải phóng diễn ra nhanh chóng, làm giảm chất lượng sản phẩm. Chính vì thế, nhiệt độ xử lý thích hợp được lựa chọn là 240C.
pH xử lý Thời gian xử lý (giờ) Nhiệt độ xử lý (oC) % protein được giải phóng Tỷ lệ nấm men bị phá vỡ thành tế bào (%) 10 18 16 36.38 40 10 18 18 40.55 64 10 18 20 43.85 100 10 18 22 46.92 100 10 18 24 47.28 100 10 18 26 47.30 100 10 18 28 47.28 100 l
4.1.2. Phá vỡ thành tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân
Tự phân là quá trình phân hủy thành phần peptido –glucan ở thành tế bào bởi phức hệ enzym của tế bào được khỏi trạng thái liên kết khi xử lý tế bào nấm men bằng các tác nhân xử lý, làm proteaza và những enzym khác thoát ra ngoài môi trường dễ dàng. Từ đó, proteaza được chiết ra lại tiếp tục thủy phân. Protein, tiếp tục gây hư hỏng rồi dẫn tới phá hoàn toàn thành tế bào.
Sau khi tiến hành rửa loại đắng ta thu được nấm men có pH= 7. Đây là pH thích hợp cho các phức hệ enzym bao gồm có glucanaza, manaza, proteaza, xylanza chiết xuất ra, phân cắt các thành phần glucan, manana, gây hư hỏng mạng lưới cấu trúc thành tế bào, là cơ sở cho phương pháp phá hủy thành tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân. Do vậy, ta chọn pH= 7 là pH của môi trường để tiến hành phương pháp tự phân. Sau khi đã chọn được pH ta tiếp tục nghiên cứu xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình tự phân.
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình tự phân của thành tế bào