trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos.
Trong dịch quả nước cacao có các loại đường chính với hàm lượng tương đối lớn, gồm: frutose, glucose và saccharoze. Để tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường đến sự sinh trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos, chúng tôi tiến hành sử dụng môi trường cơ bản có bổ sung như sau:
‒ M1: bổ sung đường saccharose: 20g/l ‒ M2: bổ sung đường fructose: 20g/l ‒ M3: bổ sung đường glucose: 20g/l
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
2.2.4.2. Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn thích hợp bổ sung vào dịch vang non trong lên men malolactic
Để bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos vào thực hiện quá trình lên men malolactic ta cần xác định lượng giống vi khuẩn đưa vào sao cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Chúng tôi tiến hành bổ sung 3 tỉ lệ giống khác nhau là:
‒ ĐC: không bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos
‒ M1: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 5g/l ‒ M2: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 10g/l ‒ M3: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 15g/l
Các mẫu trên được cấy vào dịch rượu vang cacao non đã lên men rượu 7 ngày và tiến hành lên men malolactic trong 20 ngày.
Trong quá trình lên men và sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic, chúng tôi thu mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, độ rượu.
2.2.4.3. Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos trong lên men malolactic.
Sau khi khảo sát có được tỉ lệ giống thích hợp, tiến hành khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn. Dịch nước cacao sau khi được xử lí sẽ điều chỉnh độ Brix đến 25 và pH = 4. Sau đó bổ sung giống nấm men Saccharomyces cerevisiae với tỉ lệ 2%V và bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos với tỉ lệ đã nghiên cứu qua thí nghiệm ở mục 2.4.2.2 với các thời điểm như sau:
‒ ĐC: mẫu đối chứng, không bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ M1: bổ sung đồng thời cả chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ M2: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos vào thời điểm nấm men phát triển ở pha logarit, tức là ngày thứ 3 của quá trình lên men chính.
Quá trình lên men chính là 7 ngày và lên men malolactic là 20 ngày. Sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic, chúng tôi tiến hành các chỉ tiêu về: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, độ rượu sau quá trình lên men.
2.2.4.4. Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite
Rượu vang cacao sau khi qua quá trình lên men malolactic có một độ đục nhất định. Để nghiên cứu hiệu quả lắng trong cũng như tốc độ lắng của rượu vang theo thời gian. Chúng tôi sử dụng bentonite được pha thành dung dịch 10% trong nước và được chia với các tỉ lệ khác nhau từ 0 – 5g/l bổ sung vào rượu vang cacao đã lên men malolactic.
Tiến hành lấy mẫu và đo OD theo từng ngày để xác định độ trong và tốc độ lắng trong theo thời gian.
2.2.5. Các phương pháp phân tích 2.2.5.1. Phương pháp phân tích Vật lí
a. Kiểm tra độ Brix
Sử dụng Brix kế của phòng thí nghiệm hóa sinh.
Cách thực hiện:
Dùng đũa khuấy khuấy nhẹ dung dịch cần đo nồng độ chất hòa tan, lấy ra một giọt chấm vào mặt kính. Đậy nắp kính lại. Quan sát và đọc độ Brix qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Xoay nhẹ ống kính để nhìn rõ nếu thấy thang đo bị mờ. Sau đó rửa lại kính bằng nước cất và lau khô nhẹ nhàng bằng giấy thấm.
b. Kiểm tra pH
Sử dụng máy đo pH Mettler của phòng thí nghiệm vi sinh.
Cách tiến hành:
Rửa sạch đầu đo, lau khô bằng giấy thấm, nhúng đầu đo vào dung dịch cần đo. Khi máy hiện lên “pH” thì có thể đọc giá trị pH trên màn hình. Khi đo nhiều lần liên tiếp thì sau mỗi lần đo, làm sạch bằng cách nhúng đầu đo vào nước cất. Sau khi đo xong, rửa sạch đầu đo, lau khô và tắt máy.
Cách tiến hành:
Dùng bình định mức lấy chính xác 500ml hoặc 250ml rượu ở 20oC (tuỳ theo loại rượu kế), rót cẩn thận vào bình cầu của bộ cất rượu. Lấy khoảng 100ml nước cất, tráng rửa bình định mức vài lần để chuyển vào bình cầu. Lắp hệ thống cất, hứng dịch cất vào bình định mức vừa tráng nói trên, trong bình này chứa sẵn 50ml nước cất. Sau khi cất được 3/4 bình hướng và nhiệt độ hơi cất đạt 100oC thì ngừng cất thêm nước cất đến vạch mức rồi giữ ở nhiệt độ 20oC trong 30 phút. Sau đó thêm nước cất đến vạch, lắc đều rồi tiếp tục tiến hành theo TCVN 378-86.
d. Phương pháp đo OD
Sử dụng máy đo quang của phòng thí nghiệm vi sinh.
Cách tiến hành:
Sử dụng pipepman mang hút 1ml huyền phù rồi pha vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng bằng nồi hấp Autoclear. Dùng Vortex lắc đều dung dịch trong ống nghiệm. Đổ dung dịch ra cuvet rồi tiến hành đo OD theo bước sóng thích hợp. Đợi số chỉ trên màn hình ổn định thì ghi lại. Tiến hành đo 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.2.5.2. Phương pháp phân tích Hóa học
Sử dụng phương pháp phân tích hóa học để xác định hàm lượng acid có trong rượu vang theo TCVN 1273 – 1986.
a. Dụng cụ và thuốc thử
Buret, dung tích 10ml, khắc vạch 0,05ml; pH Mettler; dung dịch NaOH 0,1N. b. Tiến hành thử
Lấy chính xác 10ml rượu cho vào cốc, dung tích 100ml thêm 50 ml nước cất (đã đun sôi và để nguội). Sau đó dùng dung dịch NaOH 0,1 N vừa nhỏ giọt vừa khuấy và đo pH của dung dịch. Việc chuyển độ kết thúc ở pH = 7.
c. Tính toán kết quả
Hàm lượng acid (X1) chuyển ra acid citric tính bằng g/l rượu theo công thức: X1 = V . 70 . 0,1 . 1000 = 0,7 V
‒ 70 – phần tử lượng acid citric, g; ‒ 0,1 – nồng độ của NaOH;
‒ 1000 – hệ số chuyển ra g/l;
2.2.5.3. Phương pháp phân tích Sinh học
Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định tổng số tế bào vi khuẩn
Leuconostoc oenos có trong 1ml huyền phù. a. Nguyên tắc
Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở cho việc định lượng tế bào trên thạch đĩa vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chính là số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó.
Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa petri có môi trường thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả phát triển của một tế bào.
b. Thao tác đổ đĩa, cấy giống nấm men
‒ Ghi trên đáy đĩa: tên mẫu, ngày cấy, nồng độ pha loãng. ‒ Bật đèn UV khử trùng phòng cấy trước lúc cấy 20 – 30 phút.
‒ Các dụng cụ và môi trường phải được tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút.
‒ Thực hiện đổ đĩa, với mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường. Xoay đĩa theo hình số 8 để môi trường phân bố đều trong đĩa, để yên để môi trường đặc hoàn toàn.
‒ Dùng pipetman vô trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa. Dàn đều bằng que gạt thủy tinh.
‒ Đặt tất cả các đĩa đã cấy vào tủ ấm, nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. c. Cách đếm khuẩn lạc
Dùng bút lông kim và thước kẻ chia đáy hộp ra 4 phần, lần lượt đếm các khuẩn lạc có trong từng phần.
d. Công thức tính
3.1. Các yếu tố ảnh hướng đến sinh triển và phát triển của chủng vi khuẩn
Leuconostoc oenos.
3.1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
Theo Lê Thị Liên Thanh thì vi khuẩn Leuconostoc oenos là một vi khuẩn Gram dương (Gr+) nằm trong hệ vi khuẩn sinh acid lactic chịu được độ cồn và acid tương đối cao như ở rượu vang và sâm – panh. Leuconostoc oenos có kích thước nhỏ nhất trong các loại vi khuẩn lactic có trong rượu vang, đường kính tế bào của chúng thường nhỏ hơn 0.7 micromet. [2], [5]
Hình 3.1. Hình ảnh của vi khuẩn Leuconostoc oenos dưới kính hiển vi
Nhuộm Gram và quan sát tế bào vi khuần Leuconostoc oenos dưới kính hiển vi ta thấy các tế bào có dạng hình trứng dài, kích thước rất nhỏ. Tuy nhiên kích thước và hình dạng của tế bào thay đổi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy. Các tế bào vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chùm 2, 3 tế bào hoặc kết thành chuỗi, các tế bào đều là vi khuẩn Gram dương, không chuyển động, không sinh bào tử. Kết quả cho thấy sự các đặc điểm hình thái của vi khuẩn Leuconostoc oenos phù hợp với các nghiên cứu đã công bố trước.
Thực hiện phương pháp cấy trải theo các độ pha loãng khác nhau trong các đĩa peptri đựng môi trường MT2 có bổ sung thêm dịch vang non cacao ủ ở nhiệt độ môi trường trong 48h. Các khuẩn lạc xuất hiện sau 48h nuôi cấy quan sát thấy kích
Hình 3.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Leuconostoc oenos trên môi trường MRS – Agar có bổ sung dịch vang cacao non
Các kết quả trên cho thấy vi khuẩn Leuconostoc oenos phát triển nhanh trên môi trường MRS có bổ sung dịch vang non cacao. Đây là môi trường cung cấp đầy đủ các dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos, việc bổ sung dịch vang cacao non tạo khoảng pH phù hợp, không cần phải sử dụng đến hóa chất, cung cấp các yếu tố vi lượng mà môi trường nhân tạo không thể có cũng như tạo môi trường bán nhân tạo cho Leuconostoc oenos phát triển.
3.1.2. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
Để nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos
theo thời gian, nhằm xác định thời điểm thích hợp để thu sinh khối, chúng tôi tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Sau khi tiến hành đếm khuẩn lạc và tính toán số lượng tế bào vi khuẩn trên 1ml huyền phù theo các bước như mục 2.2.4.1.
Đồ thị 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos
Kết quả cho thấy, Leuconostoc oenos phát triển tốt, thích nghi nhanh với môi trường và đạt cực đại sau 48h nuôi cấy và số lượng tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos lên đến 109 tế bào trên 1 ml huyền phù. Các kết quả trên phù hợp với các nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh đã đưa ra.
Từ đây thấy rằng, để thu sinh khối cho quá trình lên men malolactic, nên chuẩn bị nuôi cấy giống vi khuẩn trước 2 ngày so với thời gian kết thúc lên men chính.
3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sự sinh trưởng của Leuconostoc oenos.
Độ cồn cao (70 – 99%V) thường có khả năng sát khuẩn. Ở các vi khuẩn Gram(+): do các thành tế bào rất dày và hàm lượng peptido cao, vì vậy cồn không
1 ml huyền phù (A) 0 3.55.E+02 2.550 4 6.26.E+02 2.797 8 1.63.E+03 3.212 12 2.90.E+03 3.462 16 7.00.E+03 3.845 20 1.21.E+04 4.083 24 5.55.E+05 5.740 28 4.70.E+06 6.672 32 9.75.E+06 6.989 36 2.90.E+07 7.462 40 1.03.E+08 8.013 44 9.75.E+08 8.989 48 6.44.E+09 9.809 52 5.32E+08 8.726 56 8.67E+07 7.938 60 6.60E+07 7.820 72 1.31E+06 6.117 84 7.75E+05 5.889 96 5.15E+04 4.712 108 1.90E+04 4.279
nhưng cũng có thể ức vi khuẩn phát triển cũng như giảm lượng sinh khối thu được. [14]
Do độ cồn trong rượu vang thường từ 6 – 15%V, vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi cấy Leuconostoc oenos ở môi trường cơ bản có có điều chỉnh độ cồn như sau: M1: độ cồn = 0%V; M2: độ cồn = 5%V; M3: độ cồn = 10%V; M4: độ cồn = 12%V; M5: độ cồn = 15%V.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và đồ thị 3.4.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến OD của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
Ngày M1 M2 M3 M4 M5 0 0,064 0,064 0,064 0,064 0,064 1 0,852 0,625 0,366 0,240 0,154 2 0,912 0,829 0,641 0,405 0,239 3 1,103 1,009 0,764 0,570 0,370 4 1,019 0,950 0,850 0,755 0,413 5 0,972 0,927 0,829 0,769 0,470 6 0,943 0,897 0,776 0,617 0,442
Các số liệu cho thấy, ở nồng độ cồn thấp (từ 0 – 5%V), vi khuẩn phát triển bình thường và cho giá trị OD cực đại chỉ sau 3 ngày nuôi cấy. Còn ở môi trường có nồng độ cồn cao ( 10, 12, 15%V) thì thấy vi khuẩn phát triển cực đại sau 4 hoặc 5 ngày. Như vậy, rõ ràng nồng độ cồn cao sẽ kéo dài giai đoạn tiềm phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
Hơn nữa, giá trị OD của các mẫu môi trường có độ cồn thấp cao hơn so với giá trị OD của các mẫu môi trường có độ cồn cao. Như vậy, nồng độ cồn cao còn ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos. Các kết quả trên phù hợp với các nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh đã đưa ra.
Qua thí nghiệm trên, cho thấy rằng, hàm lượng cồn ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos. Độ cồn cao không những kéo dài giai đoạn tiềm phát triển của vi khuẩn mà còn ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn.
3.1.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến sự sinh trưởng và phát triển của
Leuconostoc oenos.
Nitơ hữu cơ là một trong những nguồn dinh dưỡng quan trọng cho vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Leuconostoc oenos nói riêng. Peptone, cao thịt và cao nấm men cũng cấp chủ yếu các acid amin, peptide, polypeptide cho nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn. Theo Versari và cộng sự (1999), việc bổ sung thành phần acid amin vào môi trường nuôi cấy rất cần cho sự sinh trưởng tối đa của vi khuẩn lactic. Sự ảnh hưởng của các acid amin đến sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic cũng như cơ chế vận chuyển của chúng cũng đã và đang được nghiên cứu. [2], [5]
Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cơ bản có bổ sung nguồn nitơ như sau: M1: peptone nồng độ 15g/l; M2: cao thịt bò nồng độ 15g/l; M3: cao nấm men nồng độ 15g/l; M4: hỗn hợp các nguồn nitơ trên với nồng độ mỗi loại là 5g/l.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và đồ thị 3.5.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến OD của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
Ngày M1 M2 M3 M4 0 0,092 0,071 0,069 0,091 1 0,138 0,185 0,148 0,173 2 0,320 0,583 0,409 0,657 3 0,405 0,609 0,675 0,964 4 0,385 0,531 0,613 0,884 5 0,374 0,480 0,512 0,818
Kết quả cho thấy, các mẫu đều cho giá trị OD cực đại vào ngày nuôi cấy thứ 3. Tuy nhiên, các giá trị này đều có sự chênh lệch lớn. Mẫu M1 cho giá trị OD thấp nhất. Các mẫu M2, M3 cho các giá trị trung bình và gần tương đương nhau. Và mẫu M4 cho giá trị OD cao nhất. Các kết quả trên phù hợp với các nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh đã đưa ra.
Qua biểu đồ cũng như bảng kết quả, chúng ta có thể kết luận rằng trong môi trường riêng rẽ các nguồn nitơ thì vi khuẩn đều phát triển tốt, cao nhất ở cao nấm men, sau đó đến cao thịt bò và cuối cùng là peptone. Tuy nhiên, môi trường tốt nhất là môi trường có chứa của 3 nguồn nitơ trên.
Những kết quả trên có thể giải thích như sau: peptone là một hỗn hợp của polypeptide và acid amin được hình thành bởi một phần thủy phân của protein. Việc phân giải các polypeptide thành peptide làm mất nhiều năng lượng hơn, chính vì vậy, ở môi trường nuôi cấy chỉ có pepton, vi khuẩn phát triển chậm nhất. Cao