a) i u tra thu th p m u b nh ph m Qu ng Tr và Gia Lai: ti n hành đi u tra tình hình b nh h i s d ng ph ng pháp baseline và thu m u b nh.
b) Ti n hành phân l p và thu th p qu n th Phytophthora:
Ph ng pháp phân l p P. capsici t mô b nh: sau khi r a m u b nh ph m d i n c máy đ lo i b đ t và b i b n, v sinh b m t v t b nh b ng c n Ethanol 70%, c t m u b nh thành t ng mi ng c y nh kho ng 5mm x 5mm, ch a c mô b nh và mô kh e, sau đó đ t lên môi tr ng PSM.
Ph ng pháp phân l p b ng b y du đ ng bào t : L y 50g đ t vùng quanh g c r , sâu cách m t đ t 5-15cm c a cây b nh, bóp v n đ t và cho vào c c nh a. Sau đó thêm vào c c 100ml n c c t. Th n i trên m t n c c a c c m t lá tiêu bánh t gi ng V nh Linh. t c c trong đi u ki n phòng thí nghi m kho ng 25-300C, d i ánh sáng tán x . Quan sát v t b nh xu t hi n trên lá sau 2-5 ngày. V t b nh xu t hi n, ti n hành phân l p m u b nh trên môi tr ng PSM.
Ph ng pháp làm thu n và b o qu n m u n m b nh: Ti n hành c y truy n và làm thu n
m u n m b ng ph ng pháp c y đnh sinh tr ng. S d ng ph ng pháp b o qu n m u n m trong l McCartney có ch a n c c t vô trùng n c đ b o qu n n m dùng đ s d ng trong quá trình lây b nh nhân t o và phân tích đa d ng di truy n ho c các thí nghi m khác. L b o qu n n m đ c đ n i mát m nhi t đ phòng thí nghi m.
c) ánh giá ph ký ch c a n m P. capsici phân l p t h tiêu b ng s d ng
ph ng pháp lây b nh nhân t o.
S d ng lá bánh t , s ch b nh c a các cây tr ng và th c v t m c trong v n h tiêu. R a s ch lá cây tr ng b ng n c c t. Dùng gi y th m qu n cu ng lá r i đ t lá lên khay có 3 l p gi y th m t đ m n c. S d ng ph ng pháp lây nhi m áp th ch (kích th c 2 – 3 mm x 2 – 3 mm) đ c c t ph n rìa t n n m lên lá. Sau khi bao khay l i
22
b ng nilon, đ t khay trong đi u ki n t i, nhi t đ 18-200C. Ti n hành quan sát v t b nh sau 2 ngày lây nhi m. Quan sát tri u ch ng và đo đ ng kính v t b nh.
d) Nghiên c u đ c tính c a 2 th phân l p A1 và A2 P. capsici
Ph ng pháp lây nhi m áp th ch: s d ng isolate c a hai th phân l p đ i ngh ch A1 và A2 c y trên môi tr ng PDA. Ch n lá bánh t , tr ng thành, s ch b nh trên cây tiêu và cây cao su. Sau khi v sinh lá b ng n c c t, c y 2 mi ng th ch có kích th c 2 – 3 mm m i chi u c a 2 th phân l p A1 và A2 lên trên cùng 1 lá. Sau đó dùng bao nilon c l n b c c cây l i. t cây trong đi u ki n bình th òng trong phòng thí nghi m. Ti n hành quan sát quá trình cây nhi m b nh và s phát tri n c a v t b nh.
Ph ng pháp quan sát s hình thành bào t tr ng (oospore) trên mô th c v t: Thu
nh ng lá có v t b nh giao nhau c a 2 th phân l p A1 và A2, c t nh mô b nh thành nh ng m u có kích th c kho ng 1cm2. Cho vào c c ch a 20ml dung d ch Etanol 96% và đun v a l a trong th i gian 5 phút. V t m u lá b nh ra và r a qua n c c t. Sau khi tách lo i b ph n bi u bì d i c a m u lá b nh, đ t m u b nh lên lam kính. Cho m t gi t dung d ch Glycerol 50% lên m u lá b nh, đ y lamen l i và đem quan sát d i kính hi n vi đ tìm bào t tr ng.
Ph ng pháp lây b nh nhân t o vào đ t tr ng cây: Ngu n b nh cho lây nhi m nhân t o
đ c nhân sinh kh i trên giá th bao g m h t kê (30% th tích) và tr u (70%). H t kê và tr u đ c ngâm trong n c c t qua 1 đêm. G n b n c th a và cho 500ml h n h p giá th vào bình tam giác có th tích 1000ml. Sau khi làm kín bình th t ch t b ng nút bông gòn và bên ngoài b c m t l p gi y b c, ti n hành h p kh trùng nhi t đ 1210C, 1,2 atm và trong 30 phút. C y các mi ng th ch có n m P.capsici đ c nhân nuôi trên môi tr ng PDA vào giá th trong đi u ki n vô trùng, sau đo đ t các bình tam giác trong đi u ki n t i nhi t đ 25 - 300C. Sau 2-3 ngày thì l c bình m t l n đ các s i n m đ t ra và phát tri n nhanh h n và đ n m đ c phân b đ u trong giá th . Sau 2 tu n, ti n hành lây nhi m n m đ c nhân sinh kh i trên giá th vào đ t tr ng cây ký ch . Cây tr ng đ c tr ng kho ng 2 – 3 tháng trong ch u nh a. Sau khi l y b t ph n đ t m t, ti n hành lây nhi m m t l ng kho ng 20 – 40 ml h n h p giá th có ch a n m vào ch u cây và l p
23
đ t l i. Ch u cây đ c t i n c và đ t trên m t cái khay đ tránh t p nhi m và đ m b o đ m cho bào t đ ng hình thành, phát tán và xâm nh p. Sau khi bao b m t ch u l i b ng nilon đen, đ t các ch u cây đã lây nhi m b nh trong đi u ki n thoáng mát, đ thu n l i cho quá trình xâm nhi m c a n m.
e) Nghiên c u genotype di truy n qu n th P. capsici:
Qui trình chi c xu t DNA
Các isolate đ c nuôi c y trong môi tr ng d ch l ng nhân t o theo ph ng pháp c a Zhang et al. (2004). Sau đó thu ho ch s i n m và làm khô b ng gi y th m vô trùng. S d ng ph ng pháp FastPrep DNA kit đ chi c xu t DNA. N ng đ DNA đ c ki m tra tr c khi s d ng đ nghiên c u đa d ng di truy n.
Phân tích DNA
Ph n ng PCR đ c ti n hành theo qui trình: h n h p ph n ng g m 20µL dung d ch đ m, 0,5mM MgCl2, 1 đ n v Taq DNA polymerase, dATP, dCTP, dGTP và dTTP m i lo i 0,05mM, 0,2 µM primer và 20 ng ADN. Ph n ng PCR đ c th c hi n theo chu k nhi t: giai đo n kh i đ u bi n tính nhi t đ 95 °C trong 10 phút, sau đó là 35 chu k khu ch đ i (đ i v i các primer ACA, AG, CGA, GT, TG) và 37 chu k (CCA) nhi t đ 95 °C trong 30 giây, 45 giây 49 °C (AG), 47 °C (ACA), 60°C (CGA), 61 °C (CCA), 58 °C (GT), 53 °C (TG), 72 °C trong 2 phút cho giai đo n kéo dài và 72 °C trong 7 phút cho giai đo n cu i cùng (Hantula et al. 1996; Hantula et al. 1997).
S n ph m PCR đ c đi n di môi tr ng gel g m 0,8% SynerGel và 0,8% Agarose trong dung d ch đ m TBE đi u ki n 70V trong 2.30 gi . Ti n hành nhu m ethidium bromide (10 mg/L) trong 30 – 45 phút, sau đó quan sát trên máy UV và s d ng máy nh k thu t s đ ghi l i hình.
24 B ng 1.3. RAMS primer và trình t c a chúng Primer Trình t A (5’–3’) ACA BDB(ACA)5 AG HBH(AG)7A CCA DDB(CCA)5 CGA DHB(CGA)5 GT VHV(GT)5G TG HVH(TG)7T A
Các nuleotic sau là đ c ch n l a cho các v trí: B (G, T ho c C), D (G, A ho c T), H (A, T ho c C) và V (A, C ho c G)
25