0 LM 1 LM 2 LM 3 Ngày
LM0: lấy máu nền trước khi tiêm vacxin LM1: lấy máu lần 1 sau 10 ngày tiêm mũi ñầu LM2: lấy máu lần 2 sau 20 ngày tiêm mũi ñầu LM3: lấy máu lần 3 sau 30 ngày tiêm mũi ñầu
2.3.5. Phương pháp ñịnh lượng kháng nguyên HA bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A O O O O O O O O O O O O B O O O O O O O O O O O O C O O O O O O O O O O O O D O O O O O O O O O O O O E O O O O O O O O O O O O F O O O O O O O O O O O O G O O O O O O O O O O O O H O O O O O O O O O O O O
+ Nguyên tắc phản ứng HA: Kháng nguyên HA có ñặc tính ngưng kết hồng cầu của một số ñộng vật máu nóng. Dựa trên nguyên tắc này ñể ñịnh lượng HA bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà 1%.
+ Cách thực hiện
- Phân bố mẫu theo hàng ngang hay hàng dọc tuỳ theo ước lưọng mẫu có hiệu giá cao hay thấp. Mỗi mẫu thực hiện lặp lại hai lần.
- Mẫu thử ñược pha loãng 1/10 (ở giếng A): 10µl mẫu thử + 90µl PBS chứa 0,5% BSA
- Cho vào các giếng từ hàng B ñến hàng H : 50µl PBS chứa 0,5% BSA Pha loãng bậc 2: hút 50µl mẫu ở hàng giếng A cho vào hàng giếng B cứ tiếp tục pha loãng ñến hàng thứ H. Hút 50µl ở hàng thứ H bỏ ñi.
- Cho 50µl BPS chứa 0,5% BSA vào 4 giếng cho mỗi loại chứng, tiếp tục cho 50µl hồng cầu 1% vào các giếng chứng hồng cầu. Chứng dương thay mẫu thử bằng kháng nguyên chuẩn, chứng âm thay mẫu thử bằng dịch niệu nang không gây nhiễm virus.
- Nhỏ 50µl hồng cầu gà 1% trong PBS chứa 0,5% BSA vào mỗi giếng - Lắc ñều trong một phút, ñể phiến nhựa ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút
+ Đọc kết quả
Độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn còn gây ngưng kết hồng cầu ứng với một ñơn vị ngưng kết. Giá trị ngược lại của ñộ pha loãng là hiệu giá của ngưng kết kháng nguyên.
2.3.6. Phương pháp chuẩn ñộ kháng thể kháng HA ( hiệu giá HI ) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu
+ Nguyên tắc: Kháng nguyên HA của virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số ñộng vật máu nóng.
Huyết thanh chứa kháng thể ñặc hiệu kháng HA sẽ ức chế khả năng này, ngăn không cho HA ngưng kết hồng cầu, phản ứng này xảy ra ngược với phản ứng ngưng kết hồng cầu nên gọi là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu.
+ Cách thực hiện
Huyết thanh sau khi tách ñược bất hoạt bằng cách ủ ở 560C trong 30 phút. Lấy huyết thanh ra, ñể nguội ở nhiệt ñộ phòng sau ñó bổ sung vào 0,1 ml huyết thanh 0,2ml dung dịch Kaolin 25% và 0,1ml dung dịch PBS 0,01M (pH = 7,2), Lắc ñều hỗn hợp ñể ở nhiệt ñộ phòng 20 phút. Ly tâm thu dịch nổi, bổ sung 0,1ml hồng cầu gà 50%, ủ hỗn hợp ở 40C trong 1 giờ. Ly tâm lấy nước nổi bảo quản ở 40 C. Mẫu huyết thanh ñã ñược pha loãng 1/4.
b. Phản ứng chính
- Cho 25µl PBS/BSA vào mỗi giếng, cho 25µl PBS/BSA vào tất cả các giếng của cột 10,11,12.
- Cho 25µl mẫu vào các giếng của cột số 1 và cột 10, mỗi mẫu thực hiện 2 lần. Pha loãng bậc 2 mẫu thử từ cột số 1 ñến cột 9 (1/8 1/2048). Pha loãng bậc 2 mẫu thử từ cột 10 12 (1/8 1/32)
- Bỏ 25µl dung dịch mẫu ở các giếng của cột 9 và cột 12. Cho 25µl dung dịch kháng nguyên 4HA vào các giếng từ cột số 1 9. Lắc phiến trong 1 phút. Để ở nhiệt ñộ phòng trong 1 giờ. Thêm vào tất cả các giếng 25µl dung dịch hồng cầu gà 1%. Đọc kết quả sau 0,5 ñến 4 giờ.
c. Đọc kết quả: Dương tính ( + ): Kháng nguyên bị ức chế không gây ngưng
kết hồng cầu. Âm tính ( -): Kháng nguyên không bị ức chế gây ngưng kết hồng cầu.
2.4. Xử lý và phân tích số liệu
Các số liệu ñược xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft excel 2003 và phần mềm MSTATC, phân hạng trắc nghiệm LSD 0.05 và 0.01.
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến hiệu suất hấp phụ (LE) và khả năng hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A /H1N1.
Nghiên cứu sự hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1 của các hạt nano chitosan với các khối lượng phân tử khác nhau, từ ñó ñánh giá tiềm năng làm tá chất cho vacxin cúm A/H1N1 của hạt nano chitosan. Chúng tôi sử dụng 0,9ml dung dịch hạt nano chitosan (0.5mg/ml) với các khối lượng phân tử khác nhau (20, 30, 300kDa) hấp phụ với 0.1ml vacxin cúm A/H1N1 chứa 128HA (hiệu giá vacxin cúm A/H1N1 là 30µg/ml). Thời gian ủ là 30 phút, li tâm hỗn hợp ở 12000rpm ở 40C trong 10 phút, thu dịch nổi và xác ñịnh trị số HA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gà. Kết quả thu ñược theo bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến hiệu suất hấp phụ (LE) và khả năng hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A H1N1 Khối lượng phân tử nano chitosan Tỉ lệ nano CS (mg/ml) HA trong dịch nổi (HAU) Tổng HA (HAU) Hiệu suất hấp phụ LE (%) Khả năng hấp phụ LC (HA/mg) 20kDa 0,5 0 128 100 256 30kDa 0,5 4 128 96,87 248 300kDa 0,5 8 128 93,75 240 Đối chứng 0 128 128 0 0
0 20 40 60 80 100 120
chứng 20kDal 30kDal 300kDal (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu suất hấp phụ (%)
Hình 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến hiệu suất hấp phụ (LE) kháng nguyên cúm A/H1N1.
256 248 240 230 235 240 245 250 255 260
20kDal 30kDal 300kDal
Khả năng hấp phụ
Hình 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến khả năng hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A/ H1N1.
Kết quả bảng 3.1, hình 3.1 và 3.2 cho thấy khối lượng phân tử hạt nano chitosan có ảnh hưởng ñến khả năng hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1. Hạt nano có khối lượng phân tử 20kDa hiệu suất hấp phụ ñạt 100% cao hơn hạt nano chitosan 30 và 300kDa là 96.87% và 93.75%. Khả năng hấp phụ kháng nguyên
cúm của nano chitosan 20kDa là 256HA/mg, 30kDa là 248HA/mg và nano chitosan 300 kDa là 240HA/mg. Tuy nhiên, sự khác biệt là không lớn (không có ý nghĩa thống kê), hiệu suất hấp phụ của cả ba loại hạt nano chitosan với kháng nguyên cúm A/H1N1 ñều >90%. Kết quả này cao hơn nghiên cứu của Ana Vila khi hấp phụ nano chitosan với vavxin uốn ván ñạt hiệu suất hấp phụ 50-60% [34]. Myaryan Amidi (2007) khi hấp phụ vacxin cúm tiểu phần H3N2 trên N-trimethyl chitosan nanoparticles có kích thước trung bình 800nm ñạt hiệu suất hấp phụ là 78% [10] .
Vì vậy cả ba loại hạt nano chitosan (20, 30, 300kDa) ñều có khả năng hấp phụ cao ñối với vacxin cúm A/H1N1và có tiềm năng làm tá chất cho vacxin cúm A/H1N1. Do ñó chúng tôi nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan làm tá chất cho vacxin cúm A/H1N1 và thử nghiệm ñáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng.
3.2. Nghiên cứu tính an toàn và ñáp ứng miễn dịch trên chuột của vacxin cúm A/H1N1 khi sử dụng tá chất nano chitosan.
Một trong những yếu tố quan trọng ñối với vacxin cúm hấp phụ là xác ñịnh ñược liều lượng kháng nguyên và tá chất thích hợp ñể ñạt ñược hiệu quả kháng thể mong muốn. Các nhóm vacxin hấp phụ ñược ñánh giá tính an toàn và hiệu lực của vacxin thể hiện qua khả năng ñáp ứng miễn dịch ñây là hai yêu cầu cấp thiết ñối với bất kỳ một vacxin.
Trong thí nghiệm này, nhóm vacxin hấp phụ tá chất nano chitosan ñược so sánh với các nhóm vacxin hấp phụ tá chất khác và nhóm vacxin không sử dụng tá chất về tính an toàn và khả năng tạo ñáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt. Các nhóm chuột thí nghiệm ñược tiêm vacxin với các công thức tá chất khác nhau và nhóm chứng không sử dụng tá chất.
3.2.1 Kết quả kiểm tra an toàn
Tính an toàn là yếu tố quan trọng nhất trong nghiên cứu và ứng dụng vacxin. Để ñánh giá ảnh hưởng của tá chất hay kháng nguyên cúm hoặc là sự tác
ñộng kết hợp của cả hai thành phần ñến tỉ lệ sống và tăng trọng chuột chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm tra an toàn ñặc hiệu và không ñặc hiệu trên chuột ñể kiểm tra tỉ lệ tăng trọng trung bình của chuột ñược so sánh với nhóm chứng ñược tiêm nước muối sinh lí, theo dõi các triệu chứng sau tiêm vacxin và tỉ lệ sống của các nhóm chuột . Kết quả ñược ghi nhận trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất khác nhau (n=5)
Nhóm vacxin Tăng trọng trung bình (g) Tỉ lệ tăng trọng trung bình / 1 chuột (%) Tỉ lệ sống (%) Ngày 3 Ngày 7 KN 3.20±0.20 8.36±0.78 109,96 100 KN + Al(OH)3 3.26±0.47 8.12±0.58 102 100 KN + CS 3.14±0.27 7.86±0.52 90,16 100 KN + nano CS 3.10±0.31 8.26±0.24 96 100 Đối chứng 3.56±0.29 8.76±0.46 100 100
• Ghi chú: KN là kháng nguyên cúm A/H1N1; CS: Chitosan oligomer; nano CS: Hạt nano chitosan
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T ă n g t rọ n g t ru n g b ìn h ( g ) KN NaCl (0.9%) KN + Al(OH)3 KN + CS KN + nano CS Ngày 3 Ngày 7
Hình 3.3: Tăng trọng chuột của các lô vacxin cúm A/H1N1 hấp phụ các loại tá chất khác nhau
Kết quả bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy tăng trọng chuột trung bình ở tất cả các nhóm vacxin cúm hấp phụ tá chất, không hấp phụ tá chất và nhóm chứng (tiêm nước muối sinh lí) không có sự khác biệt với P≥0.01. tỉ lệ tăng trọng chuột của các nhóm vacxin so với nhóm chứng ñạt ñược từ 90.16% ñến 109.96%. Kết quả này chứng tỏ rằng các loại tá chất sử dụng ñể hấp phụ vacxin cúm A/H1N1 không ảnh hưởng ñến tính an toàn của vacxin cúm. Tỉ lệ tăng trọng chuột ở ngày 7 so với nhóm chứng ñều ñạt tiêu chuẩn ≥60% là mức tối thiểu theo quy ñịnh của WHO. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê văn Hiệp và cộng sự về thử nghiệm các loại tá chất cho vacxin cúm A/H5N1 [5].
Thử nghiệm tăng trọng chuột là một phương pháp mang tính chất ñịnh lượng ñể nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên cũng như các thành phần khác trong vacxin ñến tăng trọng của chuột và so sánh với nhóm chứng. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng vacxin cúm A/H1N1 và các tá chất hấp phụ không gây chết chuột, tất cả chuột ñều sống khỏe mạnh và tăng trọng chuột so với nhóm chứng ñều ≥ 60% là mức tối thiểu theo quy ñịnh của WHO ñối với một số vacxin khác như ho gà, DPT, vacxin tả. Đồng thời kết quả trong bảng 3.2 còn chứng minh rằng loại tá chất hấp phụ không ảnh hưởng ñến tăng trọng và không
gây chết chuột. Theo quy ñịnh của WHO một số vacxin có ñộc tính cao có thể gây chết và ảnh hưởng lớn ñến tăng trọng của chuột như vacxin DPT, vacxin ho gà...tiêu chuẩn về tính an toàn của vacxin về tăng trọng chuột cần ñạt ñược là
≥60% so với nhóm chứng và chuột không ñược chết quá 5% (VTTC, 2000) [36]. Đối với vacxin cúm không có tiêu chuẩn này, nhưng chúng tôi ứng dụng tiêu chuẩn này trong các thí nghiệm mang tính chất thẩm ñịnh tính an toàn của vacxin cúm, tá chất nano chitosan và các loại tá chất hấp phụ vacxin cúm A/H1N1.
3.2.2. Khả năng tạo ñáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghiệm
Để nghiên cứu ñáp ứng miễn dịch trên chuột ở các nhóm vacxin khác nhau, chúng tôi tiến hành tiêm hai liều vacxin cúm cách nhau 20 ngày ở mỗi công thức vacxin cho từng nhóm chuột. Thu huyết thanh ở các ngày 10, 20 sau một liều tiêm và ngày 30 sau hai liều tiêm vacxin. Kết quả tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch và hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình ñược xác ñịnh bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu gà. Kết quả thu ñược ở bảng 3.2 và 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các loại tá chất khác nhau ñến tỷ lệ ñáp ứng miễn dịch trên chuột với vacxin cúm A/H1N1.
Nhóm vacxin Tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch (%)
10 ngày 20 ngày 30 ngày
Kháng nguyên 66.7 77.8 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Al(OH)3 + KN 77.8 100 100
CS + KN 88.9 100 100
• Ghi chú: KN là kháng nguyên cúm A/H1N1; CS: Chitosan oligomer; nano CS: Hạt nano chitosan.
Kết quả bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy, sau 10 ngày tiêm vacxin, tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ở các nhóm chuột có sử dụng tá chất ñều cao hơn nhóm không sử dụng tá chất. Ở nhóm vacxin sử dụng tá chất là nano chitosan 100% chuột trong các nhóm thí nghiệm có ñáp ứng miễn dịch, Đối với các nhóm vacxin sử dụng các loại tá chất khác và không sử dụng tá chất ñạt tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch thấp hơn. Với tá chất nhôm tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch là 77.8%, tá chất chitosan oligomer là 88.9%, ở nhóm không sử dụng tá chất là 66.7%.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch (%)
10 ngày 20 ngày 30 ngày
Kháng nguyên Al(OH)3 + KN CS + KN Nano CS + KN
Hình 3.4 : Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch của vacxin cúm A/H1N1 với tá chất nano chitosan và các tá chất khác.
Ở ngày 20, các nhóm chuột có sử dụng tá chất tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch ñều ñạt 100%, nhóm vacxin không sử dụng tá chất có tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch là 77.8%.
Ở ngày 30 sau hai liều tiêm vacxin 100% chuột ở các nhóm thí nghiệm ñiều có ñáp ứng miễn dịch tạo kháng thể. Kết quả cho thấy việc sử dụng tá chất giúp kích thích ñáp ứng miễn dịch sớm ở chuột, tạo ñáp ứng miễn dịch ñồng ñều và ổn ñịnh.
Kết quả trên ñã chứng tỏ nano chitosan là một tá chất có tính dung nạp tốt trên súc vật thí nghiệm ñồng thời có khả năng kích thích ñáp ứng miễn dịch cho vacxin cúm A/H1N1 trên chuột.
Van der Lubben (2001) nghiên cứu sử dụng chitosan và dẫn xuất của nó làm tá chất cho vacxin qua niêm mạc mũi. Hạt nano chitosan nhờ có kích thước nanomet và tích ñiện dương nên có bề mặt hấp phụ lớn do ñó tăng khả năng tạo các liên kết với kháng nguyên vacxin cúm và dễ dàng ñi qua tế bào biểu mô và thải chậm vacxin ñể kích thích ñáp ứng miễn dịch, nhờ ñó ñáp ứng miễn dịch sẽ ổn ñịnh và kéo dài [15]. Bên cạnh ñó nano chitosan là các sản phẩm sinh học ñược tạo ra từ chitosan, mà nguồn thu nhận chitosan ở Việt Nam rất lớn nhờ và sự phát triển của ngành thủy hải sản. Hiện nay rất nhiều nghiên cứu ñược tiến hành ñể ñánh giá khả năng làm tá chất của chitosan, nano chitosan và các dẫn xuất của nó. Ana Vila (2004) nghiên cứu nano chitosan làm tá chất cho vaxin uốn ván. Kết quả cho thấy thí nghiệm sử dụng tá chất nano chitosan cao gấp năm lần so với kháng nguyên uốn ván tự do sau hai tuần, tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần [34].
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại tá chất ñến hiệu giá kháng thể trung bình của chuột (n = 9)
Nhóm vacxin Hiệu giá kháng thể trung bình (HIU) 10 ngày 20 ngày 30 ngày
Al(OH)3 + KN 30 206.2b 1210c
CS + KN 17 291.5ab 1351b
Nano CS + KN 36 355.5a 1806a
Đối chứng (Nước muối sinh lý) 0 0 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
ngày 0 ngày 10 ngày 20 ngày 30
H iệ u g iá k h á n g t h ể t ru n g b ìn h ( H IU ) KN KN Al(OH) KN+CS KN+nano CS
Hình 3.5: Ảnh hưởng của các nhóm tá chất ñến hiệu giá kháng thể trung bình trên chuột nhắt.
Để nghiên cứu tác ñộng của tá chất khác nhau ñến ñáp ứng miễn dịch của vacxin cúm A/H1N1 trên chuột. Chúng tôi sử dụng liều vacxin là 3.75µg/liều ở