3.1.1. Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03 đến tháng 08 năm 2007.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thực tập vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Mẫu khảo sát
Chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: tủ sấy, nồi hấp khử trùng autoclave, tủ lạnh, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy li tâm, máy sục khí, micropipette…
Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, lame, lamelle, giấy đo pH…
3.2.3. Hóa chất
Hóa chất dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm men nhƣ cồn 960, nƣớc cất, agar, KH2PO4, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2PO4.
3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng khảo sát nuôi cấy là môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng mía, môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho.
Khảo sát sự phát triển của các chủng đƣợc phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60
B.
Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau.
Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trƣờng trên. Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía.
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phân lập nấm men 3.4.1. Phân lập nấm men
3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì
Pha mẫu với 1 ít nƣớc muối sinh lý 90/00 rồi đem cấy ria trên mặt thạch Sabouraud.
Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 48 giờ.
Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, đƣờng kính khoảng 2 – 3 mm, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái.
3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho
Chọn những chỗ bị dập, hơi có mùi rƣợu rồi cấy ria trên mặt thạch Sabourand.
Để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ.
Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái.
Sau khi xác định đƣợc đó là chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces thì đem cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng Sabouraud để tăng sinh.
3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B
3.4.2.1. Mục đích
Từ các chủng của 4 nguồn mẫu trên, chọn chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Thông số cố định
Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng mật rỉ đƣờng mía 60B. Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 100ml.
Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 36 giờ.
Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí.
3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu.
3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí 1 yếu tố, lặp lại 2 lần với 4 nghiệm thức.
Mẫu phẩm Chế
Men
bánh mì Đu đủ Nho Lần 1
3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces
Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn 2 chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất làm đối tƣợng nghiên cứu cho thí nghiệm 2.
3.4.3.1. Mục đích
Tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch thích hợp cho số lƣợng tế bào nấm men lớn nhất.
3.4.3.2. Thông số cố định
Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 300ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Số lƣợng mẫu ban đầu.
Có sục khí.
3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, đơn vị tính tb/ml.
Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud, đơn vị tính là cfu/g.
Phƣơng pháp đếm tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chỉ cho biết tổng số tế bào trong dịch nuôi cấy (bao gồm cả số tế bào sống và tế bào chết). Với mục đích nuôi cấy nấm men dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm phải cao. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa cho phép xác định số lƣợng tế bào nấm men sống trong chế phẩm, từ đó ta có thể đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm.
3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch, lặp lại 3 lần.
Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ:
T1:200 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. T2: 200 ml môi trƣờng cám gạo + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố thời gian thu hoạch có 3 mức độ: 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ.
3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm
Sau khi tiến hành xong thí nghiệm 2,chúng tôi thu hoạch sinh khối tế bào nấm men và sản xuất thành chế phẩm. Thử nghiệm trộn sinh khối nấm men với chất nền là cám gạo và bột mì, trong đó chia thành 3 phần:
Phần 1: không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung 50/000 vitamin C. Phần 3: bổ sung 10
/00 vitamin C.
Sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành đếm số lƣợng tế bào nấm men còn sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud.
3.4.4.1. Mục đích
Xác định đƣợc thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản thích hợp để nấm men có khả năng sống lâu nhất trong chế phẩm.
3.4.4.2. Thông số cố định
Thời gian bảo quản: 22 ngày. Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ phòng.
3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, đơn vị tính là cfu/g.
3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm
Các mẫu lấy từ thí nghiệm 3 và chỉ tiêu theo dõi cũng là số lƣợng tế bào sống trong 1 g chế phẩm (đơn vị tính là cfu/g), nhƣng lúc này không xét đến ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C).
3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung
S. cerevisiae từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng Sabouraud lỏng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, B. subtilis từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) trong 24 giờ ở 370C rồi cấy vào các bình nuôi cấy theo tỷ lệ sau:
Bình 1: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0B). Bình 2: 1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+1B). Bình 3: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,1B). Bình 4: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,01 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,01B).
3.4.6.1. Mục đích
Tìm hiểu ảnh hƣởng của B. subtilis lên sự phát triển của S. cerevisiae.
3.4.6.2. Thông số cố định
Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 200 ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 48 giờ.
Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí.
3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi
Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Đơn vị tính: tb/ml.
Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. Đơn vị tính: cfu/g.
3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, lặp lại 2 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ:
Môi trƣờng rỉ đƣờng: 150 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 50 ml nƣớc chiết giá đậu.
Môi trƣờng cám gạo: 150 ml môi trƣờng cám gạo + 50 ml nƣớc chiết giá đậu.
Yếu tố nồng độ B. subtilis có 4 mức độ: 0, 100, 10-1, 10-2.
3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu
Lấy 1ml dịch nấm men nuôi cấy pha loãng với 9ml nƣớc muối sinh lý 90/00, ta đƣợc nồng độ 10-1, rồi pha tiếp đến 10-2, 10-3… chọn nồng độ thích hợp cho việc đếm đƣợc dễ dàng và có độ chính xác cao. Sau đó nhỏ lên buồng đếm hồng cầu và đếm dƣới kính hiển vi ở vật kính 40X. Kết quả đƣợc tính theo công thức:
Số tế bào nấm men/1 ml = a*4000*1000*H
Trong đó:
A: số tế bào trong 1 ô nhỏ
H: hệ số pha loãng = 1/độ pha loãng
4000 = hệ số chuyển thành 1 mm3 = 1/thể tích ô nhỏ = 1/4000 mm 1000 = hệ số chuyển mm3 thành ml (1 ml = 1000 m3)
3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch)
Tế bào vi sinh vật sống là tế bào có khả năng sinh trƣởng để tạo thành một quần thể. Trên bề mặt môi trƣờng đặc, quần thể này tạo những đám có hình dạng, màu sắc riêng biệt đƣợc gọi là khuẩn lạc. Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch suy ra số tế bào sống có trong mẫu đã cấy trên mặt thạch. Ở đây đơn vị tính là cfu/ml, nghĩa là số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 ml đơn vị thể tích.
Cách tiến hành
Pha loãng mẫu: lấy 1 g chế phẩm pha loãng với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90 /00 ta đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1, tiếp tục hút 1 ml dịch thể trên pha với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2 và làm nhƣ thế khi có đƣợc nồng độ pha loãng thích hợp. Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch đã pha loãng.
Cấy trải dịch pha loãng trên đĩa thạch Sabouraud: ta sẽ cấy mỗi mẫu ở 3 nồng độ pha loãng và ứng với mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 đĩa thạch. Sau khi lắc lại dịch pha loãng, dùng pipette vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu nhỏ lên giữa đĩa thạch. Dùng que cấy trang vô trùng gạt giọt dịch trải đều khắp cho tới khi mặt thạch khô ráo.
Sau đó đem để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chú ý cần phân biệt các khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính chúng.
Tính kết quả
cfu/ml(g) = a*1/K*1/V
A: số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng. V: thể tích dịch pha loãng đƣợc cấy trên mặt đĩa thạch.
K: độ pha loãng của dịch cấy.
Lƣu ý: xem xét số khuẩn lạc ở 3 nồng độ pha loãng kế tiếp nhau(ví dụ 10-5, 10-6, 10-7). Khi nồng độ pha loãng giảm 10 lần, số khuẩn lạc trên đĩa cũng giảm xấp xỉ 10 lần và trên 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng chỉ chênh lệch nhau khoảng 10%.
điều đó chứng tỏ việc tách rời các tế bào, pha loãng cũng nhƣ dàn đều chúng trên mặt thạch diễn ra hoàn hảo và số liệu thu đƣợc là đáng tin cậy.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60 môi trƣờng rỉ đƣờng 60
B
Chúng tôi đem 4 chủng nấm men phân lập đƣợc từ 4 nguồn mẫu khác nhau nuôi trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B với thời gian nuôi cấy là 36 giờ nhằm tìm chủng có khả năng phát triển tốt nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo đƣợc thuận lợi hơn. Số liệu thu đƣợc ban đầu có đơn vị tính là tb/ml (phụ lục Bảng 7.1)
sẽ chuyển đổi về giá trị logarit để xử lý thống kê.
Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit)
Mẫu phẩm Chế Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 8,450 8,204 8,459 8,566 Lần 2 8,332 8,061 8,130 8,415 Trung bình 8,391 8,133 8,295 8,491
Qua Bảng 4.1 cho thấy số lƣợng tế bào nấm men thuộc các chủng phân lập giảm dần theo thứ tự sau:
Nho: 8,491
Chế phẩm: 8,391
Đu đủ: 8,295
Men bánh mì: 8,133
Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05 (phụ lục Bảng ANOVA
7.1).
Các loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cũng đồng hóa vật chất nhƣ nhau. Có thể nói, các loài khác nhau (dù là một giống) đồng hóa các nguồn
dinh dƣỡng là khác nhau nên tốc độ sinh trƣởng của chúng trên cùng một điều kiện nuôi cấy là khác nhau. Do đó, tuy các chủng phân lập từ 4 nguồn mẫu trên đều thuộc giống Saccharomyces nhƣng khi nuôi cấy trong cùng điều kiện môi trƣờng rỉ đƣờng 60B thì số lƣợng tế bào của chúng khác nhau là hợp lý.
Dựa theo số liệu ở Bảng 4.1, chúng tôi chọn 2 chủng đƣợc phân lập từ nho
và chế phẩm làm đối tƣợng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi nhuộm xem hình thái và thử nghiệm các phản ứng lên men đƣờng, chúng tôi xác định đƣợc chủng nấm men phân lập từ dịch quả nho thuộc loài S. cerevisiae, chủng phân lập từ chế phẩm sinh học (tên thƣơng mại là Ultra Levure) thuộc loài S. boulardii.
Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure
Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho
Hình 4.3: Hình thái S. boulardii
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces
Sau khi khảo sát nuôi cấy 2 loài S. boulardii và S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B, môi trƣờng cám gạo ở 3 mức độ thời gian 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, chúng tôi thu nhận số liệu về số lƣợng tế bào nấm men trong mỗi nghiệm thức (phụ lục Bảng 7.2, 7.3, 7.4 và 7.5). Tiếp theo, chúng tôi xử lý thống kê trên số liệu
logarit đƣợc chuyển đổi từ dạng số liệu nguyên ban đầu (đơn vị tính là tb/ml, cfu/g).
4.2.1. Saccharomyces boulardii
Bảng 4.2a: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit).
Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo
Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,427 8,505 8,394 8,453 8,536 8,385 Lần 2 8,443 8,491 8,533 8,362 8,398 8,293 Lần 3 8,282 8,411 8,445 8,394 8,447 8,470
Bảng 4.2b: giá trị trung bình của bảng 4.2a
36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,384 8,469 8,457 8,437
Cám gạo 8,403 8,460 8,383 8,415 Chung 8,394 8,465 8,420
Qua Bảng 4.2 cho thấy tổng số tế bào S. boulardii trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. boulardii trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,437>8,415). Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii ở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 giờ và 36 giờ (8,465>8,420>8,394). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05.
Nhìn chung, mối tƣơng quan cả hai yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào nấm men không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.2).
Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit)
Môi
trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo
Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 7,537 8,546 8,834 8,175 9,041 8,537 Lần 2 8,361 8,189 8,474 9,442 8,525 8,516 Lần 3 8,975 8,406 8,569 9,389 8,331 9,316
Bảng 4.3b: giá trị trung bình của bảng 4.3a
36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,291 8,380 8,626 8,432