2.5.1. Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật
- Phƣơng pháp pha loãng: Cân 10g đất cho vào bình tam giác 250ml chứa 90 ml nƣớc pha loãng. Sau đó lắc đều. Thu đƣợc nồng độ 10-1. Lấy 1ml dịch mẫu trong bình pha loãng đất cho vào cho vào ống nghiệm đựng 9ml dịch nƣớc pha loãng đƣợc nồng độ 10-2. Tiếp tục cho các nồng độ tiếp theo.
- Chuẩn bị môi trƣờng: Chuẩn bị là các môi trƣờng Ashby, YME và MPA. Tiến hành trang đều mẫu và đƣợc ủ ở 30 – 37oC trong khoảng 24h đối với môi trƣờng MPA và trong khoảng 48h đối với 2 môi trƣờng Ashby và YME; để cho khuẩn lạc phát triển hoàn thiện. Số lƣợng tế bào đƣợc ƣớc lƣợng thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch, mỗi nồng độ pha loãng đƣợc lặp lại 2 đĩa.
Công thức xác định số lƣợng tế bào: X = a . b . 10 (CFU/ml) [5].
a: số lƣợng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri. b: nghịch đảo của nồng độ pha loãng.
2.5.2 . Phương pháp xác định chỉ số nốt sần Bảng 2.4.Các thông số xác định chỉ số nốt sần Kích thƣớc nốt sần Chỉ số (A) - Lớn (>3mm) - Trung bình (1 - 3mm) - Nhỏ (<1mm) 3 2 1 Mầu sắc Chỉ số (B) - Hồng - Trắng 2 1 Số lƣợng Chỉ số (C) - Không có nốt sần - ít (1-10) - Nhiều (>10) 0 2 3 Chỉ số nốt sần = A*B*C ≤ 18
2.5.3. Phương pháp xác định độ ẩm và hệ số khô kiệt của đất
* Nguyên tắc:
Dựa trên sự chênh lệch về khối lƣợng giữa mẫu đất khô không khí và mẫu đất khô kiệt sau khi sấy ở nhiệt độ từ 100 – 105oC đến khối lƣợng không đổi để tính độ ẩm và hệ số khô kiệt của mẫu đất.
* Cách tiến hành:
- Cân chính xác 5,0 g đất mịn khô trong không khí trên cân phân tích, cho vào hộp đựng mẫu, xác định khối lƣợng lƣợng đất và hộp. Sau đó sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100 – 105oC trong khoảng 4 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân khối lƣợng lần thứ nhất.
- Tiếp tục sấy ở 100 – 105oC khoảng 2 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng. Cân khối lƣợng lần hai và làm nhƣ vậy cho đến khi khối lƣợng lần cân sau không đổi hoặc thay đổi không quá 0,001g so với lần trƣớc.
* Tính kết quả:
- Độ ẩm (A) của mẫu đất tính bằng phần trăm nƣớc theo đất khô kiệt (%):
A % =
- Hệ số khô kiệt (K) đƣợc tính theo công thức:
K =
Trong đó: A%: Độ ẩm tính theo % trọng lƣợng đất khô kiệt (%) P1: Khối lƣợng đất ẩm (g)
P2: Khối lƣợng đất khô kiệt (g) 100: Hệ số qui đổi ra %
2.5.4. Phương pháp phân tích nitơ trong đất
2.5.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số * Phương pháp công phá mẫu:
- Cân chính xác 1g đất đã nghiền mịn và qua rây 0,2mm vào bình công phá dung tích 100ml. Làm ẩm bằng 1ml nƣớc cất, để 20 – 30 phút. Sau đó bổ sung vào đó khoảng 10g hỗn hợp xúc tác và thêm vào 10 ml H2SO4 đậm đặc.
- Đun nhẹ trên bếp đến khi sủi bọt thì nâng dần nhiệt độ và duy trì nhiệt đến khi công phá hoàn toàn. Thời gian công phá khoảng 3 – 4h đồng hồ.
- Sau khi công phá thì để nguội và cho vào khoảng 20ml nƣớc cất và để lắng cặn. Gạn nƣớc trong qua bình và định mức lên 100ml bằng nƣớc cất.
* Thủ tục cất mẫu:
- Bình hứng chứa 30ml acid boric 2%, có bổ sung 1 – 2 giọt chỉ thị màu. - Bình chƣng cất: bổ sung 50 ml dịch chƣng cất và 50 ml NaOH 40%. - Thời gian cất là 5 phút kể từ khi sôi dịch.
* Chuẩn độ:
- Mang dịch đã chƣng cất chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn độ HCl. - Chuẩn độ dung dịch chƣng cất từ màu xanh chuyển sang màu tía nhạt thì dừng lại. Sau đó, xác định hàm lƣợng nitơ tổng số theo công thức:
K m v V N A N . . . 1000 100 . 14 . . . %
Trong đó: A: thể tích dung dịch HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu (ml) N: Nồng độ đƣơng lƣợng dung dịch HCl
V: Thể tích toàn bộ dung dịch công phá (ml) v: Thể tích dung dịch trích chuẩn độ (ml)
m: Khối lƣợng mẫu phân tích (g) K: hệ số khô kiệt [19].
2.5.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng nitơ dễ tiêu
* Thủ tục cất mẫu:
- Cân chính xác 20,0g mẫu đất cho vào bình tam giác dung tích 250ml, bổ sung vào đó 40ml dung dịch KCl 1N. Lắc trong 1 giờ, sau đó lọc dịch.
- Bình hứng chứa 20ml acid boric 2% có bổ sung 1 – 2 giọt chỉ thị màu. - Hút 20ml dịch lọc cho vào bình cất nitơ, thêm khoảng 20ml nƣớc cất và vài giọt phenolftalêin, thêm 0,5g bột MgO. Thời gian cất khoảng 5 phút.
* Chuẩn độ:
- Mang dịch đã chƣng cất chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn độ HCl. - Chuẩn độ dung dịch chƣng cất từ màu xanh chuyển sang màu tía nhạt thì dừng lại. Sau đó, xác định hàm lƣợng nitơ dễ tiêu theo công thức:
K G N V V X ( 0) .14.100.
Trong đó: X: hàm lƣợng N dễ tiêu trong đất (mg/100g)
V: thể tích dung dịch HCl chuẩn dùng khi chuẩn mẫu (ml)
V0: thể tích dung dịch HCl chuẩn dùng khi chuẩn mẫu trắng (ml) N: nồng độ đƣơng lƣợng của HCl tiêu chuẩn
G: khối lƣợng đất ứng với dịch lọc đã cất (g) K: hệ số khô kiệt [20].
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu đều đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học, phần mềm Excel và các phần mềm xử lý thông kê thông dụng khác.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên cây đậu xanh trên quy mô phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
Bƣớc đầu đánh giá tác động của vi khuẩn cố định nitơ lên cây trồng, chúng tôi đã tiến hành trên cây đậu xanh ở quy mô phòng thí nghiệm và kết quả đƣợc trình bày dƣới đây
3.1.1. Kết quả vi sinh vật trong các mẫu đất
Trong quá trình chăm sóc cây đậu, đã tiến hành lấy mẫu đất định kỳ để phân tích đánh giá sự biến động của một số nhóm vi sinh vật trong đất. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sự biến động mật độ vi khuẩn cố định nitơ tự do, nitơ cộng sinh và
vsv tổng số trong các mẫu đất trồng cây đậu xanh
Môi trƣờng Tên TN 0 ngày 30 ngày (NPK) 60 ngày (NPK) 90 ngày VSV cố định N tự do ĐC(-) 1,30 x104 2,00 x104 5,00 x104 2,90 x104 ĐC(+) 1,30 x104 2,15 x104 5,15 x104 3,80 x104 TN1 6,25 x105 3,00 x106 5,00 x106 6,40 x106 TN2 6,25 x105 3,15 x106 5,15 x106 7,20 x106 VSV cố định N cộng sinh ĐC(-) 1,65 x103 1,20 x104 3,00 x104 4,95 x104 ĐC(+) 1,65 x103 1,50 x104 3,60 x104 5,10 x104 TN1 4,30 x104 1,30 x104 4,00 x105 4,30 x105 TN2 4,30 x104 2,40 x104 4,50 x105 4,60 x105 VSV tổng số ĐC(-) 1,94 x106 2,30 x106 2,27 x107 2,08 x107 ĐC(+) 1,95 x106 4,80 x106 4,42 x107 5,10 x107 TN1 2,00 x106 2,50 x106 3,36 x107 4,02 x107 TN2 2,00 x106 5,20 x106 8,50 x107 7,85 x107
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, mật độ vi khuẩn cố định nitơ tự do trong đất ở các mẫu khác nhau có sự biến động theo thời gian sinh trƣởng của cây đậu xanh. Mật độ vi khuẩn ở các mẫu thí nghiệm (TN1, TN2) có bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn cố định N tăng theo thời gian và đạt mật độ 106 CFU/g sau 1 tháng trồng, sau đó ổn định ở mật độ này cho đến ngày kết thúc thí nghiệm. Trong khi đó ở các mẫu đối chứng mật độ vi khuẩn cố định N không có sự biến động nhiều với ngày đầu và đạt 104 CFU/g ở cuối ngày thí nghiệm.
Kết quả ở bảng 3.1 cũng cho thấy mật độ của vi khuẩn cố định N cộng sinh trong các mẫu đất thí nghiệm có bổ sung vi khuẩn cộng sinh cao hơn so với trong mẫu đất không bổ sung và tăng khoảng 10 lần.
Kết quả đánh giá mật độ của tổng vi khuẩn hiếu khí (bảng 3.1) cũng cho thấy, mật độ vi khuẩn hiếu khí trong các mẫu đất không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu thí nghiệm có bổ sung vi khuẩn cố định N với mẫu đất không bổ sung, điều này cho thấy vi khuẩn cố định N bổ sung vào đất không gây ức chế các vi khuẩn có trong môi trƣờng đất. Tuy nhiên ở các mẫu đất có bổ sung thêm mùn hữu cơ mật độ vi khuẩn hiếu khí trong đất có cao hơn, điều này có thể giải thích nhƣ sau khi bổ sung thêm mùn vào trong đất trồng, mùn hữu cơ có tác dụng làm tăng độ thông thoáng của đất, nên tạo điều kiện cho vi khuẩn hiếu khí phát triển tốt hơn.
Bên cạnh đó chúng tôi tiến hành đánh giá về chỉ số nốt sần trên cây đậu xanh, kết quả đƣợc thể hiện theo bảng 3.2
Bảng 3.2. Chỉ số nốt sần ở rễ cây đậu xanh
CHỈ SỐ ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2
KÍCH THƢỚC NỐT SẦN (A) 2 2 2 2
MÀU SẮC (B) 1 1 1 1
SỐ LƢỢNG (C) 1,895 1,915 2,655 2,84
Kết quả đánh giá chỉ số nốt sần ở bảng 3.2 cho thấy, ở các mẫu thí nghiệm chỉ số nốt sần đều cao hơn so với mẫu đối chứng, TN1 và TN2 đều có chỉ số nốt sần cao hơn so với ĐC khoảng 40,1 – 48,3%. Chỉ số nốt sần trong các mẫu bổ sung mùn cũng tăng từ 1,06 – 6,97%. Điều này cũng cho thấy vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium TN1 bổ sung vào đất đã có khả năng cộng sinh vào rễ cây đậu xanh và và mùn hữu cơ có ảnh hƣởng tốt lên cây trồng.
3.1.2. Đánh giá tác động của vi khuẩn cố định nitơ tới hàm lượng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng đậu xanh
Kết quả đánh giá tác động của vi sinh vật cố định nitơ của đến chỉ tiêu hàm lƣợng N tổng số và N dễ tiêu trong đất trồng cây đậu xanh đƣợc trình bày ở hình 3.1 và hình 3.2. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 30(NPK) 60 (NPK) 90 Tổng N, % Ngày ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2
Hình 3.1. Sự biến động của nitơ tổng số trong mẫu đất trồng đậu xanh
Từ kết quả ở hình 3.1 cho thấy, hàm lƣợng N tổng số trong đất ở tất cả các mẫu đất trong thời gian từ 0 - 30 ngày đều giảm mạnh mặc dù ở ngày thứ 30 đã bổ sung thêm phân NPK. Vì đây là thời gian cây đậu xanh phát triển mạnh sinh khối của nên nhu cầu tiêu thụ N cao.
Ở giai đoạn từ ngày 30 – ngày 60, hàm lƣợng N tổng trong các mẫu đối chứng giảm mạnh, còn trong các mẫu đất thí nghiệm N tổng số không thay đổi nhiều. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: đây là thời gian cây đậu xanh vẫn đang trong thời kỳ phát triển mạnh sinh khối nên nhu cầu sử dụng N rất cao, do vậy làm giảm hàm lƣợng N tổng trong đất, nhƣng ở các mẫu thí nghiệm bổ sung thêm vi khuẩn cộng sinh do vậy, chúng đã phát huy tác dụng cố định N bổ sung thêm nguồn N cho đất, bù đắp nguồn N mà cây đã sử dụng. Ở giai đoạn từ 60 - 90 ngày, hàm lƣợng N tổng số trong đất ở các mẫu ĐC vẫn tiếp tục giảm nhƣng giảm ít hơn so với giai đoạn từ 30 - 60 ngày, trong khi đó ở các mẫu TN thì lại có xu hƣớng tăng. Giai đoạn này nhu cầu sử dụng N của cây ít hơn, do cây đã ngừng phát triển sinh khối, mà bƣớc vào giai đoạn ra hoa và tạo quả.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 30(NPK) 60 (NPK) 90 N dễ tiêu, m g/100g Ngày ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2
Hình 3.2. Sự biến động của nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng đậu xanh
Kết quả phân tích hàm lƣợng N dễ tiêu trong đất ở hình 3.2 cũng cho thấy, sự biến động của N dễ tiêu trong đất cũng theo quy luật của N tổng số, tức là giảm mạnh trong giai đoạn đầu từ 0 - 30 ngày trong tất cả các mẫu đất. Hàm lƣợng N dễ tiêu trong các mẫu TN bổ sung vi khuẩn cố định N luôn có hàm lƣợng cao hơn so với mẫu ĐC không bổ sung vi khuẩn cố định N.
Kết quả này đã giúp chúng ta giải thích tại sao hàm lƣợng N tổng số và N dễ tiêu trong các mẫu TN luôn cao hơn trong các mẫu ĐC trong quá trình sinh trƣởng của cây đậu xanh.
Bảng 3.3. Kết quả so sánh hàm lƣợng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu trong đất
trồng đậu xanh Chỉ tiêu Mẫu thí nghiệm 0 ngày (%) 30 ngày (%) 60 ngày (%) 90 ngày (%) Nitơ tổng số TN1/ĐC(-) 104,2 109,5 110,3 125 TN2/ĐC(+) 104,2 106,8 112,5 127,1 TN2/TN1 100 102,2 104,7 104,4 ĐC(+)/ĐC(-) 100 104,8 103,9 102,8 Nitơ dễ tiêu TN1/ĐC(-) 104,8 113,7 115 125 TN2/ĐC(+) 104,8 115,4 124,4 131,6 TN2/TN1 100 103,4 110,9 111,1 ĐC(+)/ĐC(-) 100 102 102,5 105,6
Kết quả sánh hàm lƣợng N tổng sô và N dễ tiêu trong các mẫu đất trồng cây đậu xanh ở bảng 3.3 cũng cho thấy, trong các mẫu đất TN bổ sung vi khuẩn cố định N luôn có hàm lƣợng N tổng số và N dễ tiêu cao hơn so với trong mẫu ĐC, N tổng số tăng từ 4,2 – 27,1% và N dễ tiêu tăng từ 4,8 – 31,6%.
Kết quả ở bảng 3.3 cũng cho thấy, bổ sung thêm mùn hữu cơ từ rác thải sinh hoạt cũng làm tăng hàm lƣợng N trong đất, N tổng số tăng từ 2,2 – 4,7% và N dễ tiêu tăng từ 3,4 – 11,1%.
3.1.3. Đáng giá tác động của vi sinh vật cố định nitơ lên sinh trưởng và năng suất của cây đậu xanh
Sau khi đánh giá tác động của vi khuẩn cố định nitơ lên vi sinh vật đất và nitơ trong đất. Chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên sinh trƣởng của cây đậu xanh và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả đo chiều dài trung bình thân cây đậu xanh (cm) Thời gian
Tên TN
Ngày 0 Ngày 30 Ngày 60 Ngày 90
ĐC(-) 0 9,2 19,38 20,14
ĐC(+) 0 9,43 20,13 22,16
TN1 0 10,35 21,3 22,74
TN2 0 10,66 22,96 24,92
Kết quả về chiều cao trung bình của cây đậu xanh cho thấy, chiều cao trung bình cây ở phƣơng án TN1 và TN2 đều cao hơn so với 2 phƣơng án ĐC. Chiều cao trung bình cây của TN1 tăng 9,9 – 12,9% so với ĐC(-) và TN2 tăng 12,5 – 14,0% so với ĐC(+).
Từ bảng cho thấy, chiều dài trung bình mẫu ĐC(+) tăng so với ĐC(-) từ 2,5 – 10, %, chiều dài thân cây tại TN2 cũng tăng so với TN1 từ 3 – 9,6%. Qua đó có thể khẳng định việc bón mùn từ rác thải sinh hoạt và vi khuẩn cố định nitơ có tác động tốt lên sự phát triển của cây.
So sánh mức độ tăng chiều cao của cây theo thời gian cho thấy trong giai đoạn 0 – 60 ngày mức độ tăng chiều cao của cây tốt hơn so với giai đoạn 60 – 90 ngày. Điều này hoàn toàn hợp lý vì giai đoạn 0 – 60 ngày cây đang tăng trƣởng chủ yếu về sinh khối, còn giai đoạn cuối là giai đoạn cây đã chuyển sang ra hoa, quả.
Bên cạnh kết quả về chiều cao của cây, chúng tôi tiếp tục đánh giá cây thông qua khối lƣợng sinh khối cây và chiều dài rễ. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3. 38.2 40.2 44.8 48.8 4.22 4.42 4.69 5.02 0 1 2 3 4 5 6 7 0 10 20 30 40 50 60 ĐC(-) ĐC(+) TN1 TN2 (cm) g/cây Thí nghiệm
Sinh khối trung bình (g/cây) Chiều dài rễ (cm)
Hình 3.3. Sinh khối trung bình cây và chiều dài rễ cây đậu xanh
Từ kết quả ở hình 3.3 cho thấy, sinh khối trung bình cây ở cả 2 mẫu TN đều cao hơn so với ĐC. Chiều dài rễ và sinh khối trung bình ở phƣơng án không bổ sung mùn (ĐC(-) và TN1) đều thấp hơn so với phƣơng án có bổ sung mùn (ĐC(+) và TN2).
Cụ thể, chiều dài rễ cây trên các phƣơng án bổ sung mùn cao hơn so