3. Nội dung nghiên cứu
3.2.2.Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.col
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220
C
0,77kb
M 1 2 3 4 5
khả biến chủng E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton. cao nấm men. NaCl. agarose) có bổ sung kháng sinh ampicillin (100mg/l). X- gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Kết quả thu đƣợc có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng.
Hình 3.5. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli
tổ GmEXP1
Chúng tôi chọn các khuẩn lạc trắng của các mẫu nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin. nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 37oC. qua đêm. Tế bào tái tổ hợp trong các mẫu đƣợc thu lại bằng cách li tâm thu dịch đáy. Để chọn dòng chúng tôi thực hiện phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu với đoạn mã hóa của gen GmEXP1 nhằm sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn mã hóa của gen
GmEXP1 (thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng ở phần phƣơng pháp).
Chọn ngẫu nhiên 4 mẫu khuẩn của 2 giống trong đó 2 mẫu của giống SL2 và 2 mẫu của SL4 thực hiện PCR. điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ
khuẩn lạc trên gel argarose 1% với sự có mặt thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc
(M: thang DNA chuẩn 1kb; 1-2: Dòng SL2; 3-4: Dòng SL4)
Kết quả thu đƣợc một băng điện di có kích thƣớc khoảng 0.77kb đúng nhƣ kích thƣớc của đoạn mã hóa của gen GmEXP1.
3.2.3. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu
Sau khi kết quả biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt. phản ứng
PCR đã đạt mức tối ƣu. chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Sản phẩm tách plasmid sạch. đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide của gen GmEXP1
0,77kb
M 1 2 3 4 5
1 2
Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ hợp (1. SL2. 2. SL4)
Plasmid tái tổ hợp tách chiết mang đoạn mã hóa của gen GmEXP1 đƣợc quan tâm và để khẳng định chắc chắn điều này. chúng tôi tiến hành phản ứng cắt plasmid bằng enzyme BamHI. Kết quả sản phẩm cắt DNA plasmid đƣợc kiểm
tra bằng enzyme giới hạn BamHI đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE
1X với sự có mặt của maker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím. M 1 2
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym BamHI (M: thang DNA chuẩn 1kb; 1. SL2; 3.SL4)
~0.77 kb ~3.5 kb
Kết quả tách plasmid và kiểm tra plasmid tái tổ hợp đã khẳng định tách dòng thành công và mẫu có vạch tƣơng ứng với vị trí 0.77kb đƣợc sử dụng cho việc xác định trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen GmEXP1.
3.2.4. Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen GmEXP1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen GmEXP1 đã tách
dòng.chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen
GmEXP1 trên máy đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA capillary
electrophoresis system. Sau khi đọc trình tự nucleotid chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để phân tích trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1. trình tự acid amin của protein EXP1.
Trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tƣơng đƣợc chúng tôi xác định có kích thƣớc là 768 bp. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự này với trình tự đã công bố trong Ngân hàng gen quốc tế mang mã số AF516879 để khẳng định đoạn cDNA phân lập đƣợc là trình tự gen mã hoá protein GmEXP1 của cây đậu tƣơng (Hình 3.9).
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen GmEXP1 giữa giống đậu tƣơng SL2 và SL4 với đoạn mã hoá của gen EXP1 có mã số
AF516879 trong Ngân hàng gen quốc tế
Kết quả so sánh ở Hình 3.9 cho thấy các trình tự nucleotid của gen
GmEXP1 có độ tƣơng đồng cao từ 99.2% đến 99.6%. Trình tự nucleotide
đoạn mã hóa của gen GmEXP1 phân lập từ hai giống đậu tƣơng SL2 và SL4 cho thấy hệ số tƣơng đồng giữa chúng là 99.3%; so với trình tự có mã số AF516879 trong Ngân hàng gen quốc tế thì SL2 có hệ số tƣơng đồng là 99.6%. SL4 có hệ số tƣơng đồng là 99.2% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của các giống đậu tƣơng SL2. SL4. giống đậu tƣơng trên GenBank mã số AF516879 dựa trên
trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1
Bảng 3.3 còn thể hiện hệ số sai khác giữa các trình tự nucleotide từ 0.4% đến 0.8%. sự sai khác cụ thể đƣợc trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen
GmEXP1 ở 3 giống đậu tƣơng
STT Vị trí AF516879 SL2 SL4 1 93 C T T 2 271 G G A 3 278 G G A 4 438 G G A 5 536 G G C 6 550 G G C 7 646 T T A 8 722 T C C
Trong đó giống đậu tƣơng SL2 và AF516879 có mức tƣơng đồng là 99.6%. khác nhau ở 2 vị trí (93. 722). Giữa SL2 và SL4 có mức độ tƣơng đồng là 99.3%. khác nhau ở 3 vị trí (536. 550. 646); SL4 và AF516879 khác nhau ở 8 vị trí nucleotide (93. 271. 278. 438. 536. 550. 646. 722) (Bảng 3.4).
Hình 3.10. So sánh trình tự acid amine mã hoá bởi gen GmEXP1 của 3 giống đậu tƣơng SL2 và SL4 với giống công bố trong Ngân hàng gen
Hình 3.10 cho thấy đoạn mã hóa của gen GmEXP1 phân lập từ 2 giống đậu tƣơng SL2 và SL4 có kích thƣớc 768bp mã hoá cho 255 acid amine. Kết quả so sánh trình tự acid amine suy diễn của gen GmEXP1 ở hai giống đậu tƣơng SL2 và SL4 với nhau và với gen GmEXP1 của trình tự gen có mã số
AF516879 trong Ngân hàng gen quốc tế. thể hiện ở Bảng 3.5. Kết quả so sánh cho thấy hệ số tƣơng đồng về trình tự acid amine suy diễn từ 98.4% đến 99.2%; hệ số tƣơng đồng của SL2 và SL4 là 98.4%. SL2 và AF516879 là 99.2%; SL4 và AF516879 là 98.4%.
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự acid amine suy diễn
Hệ số sai khác giữa 3 trình tự acid amine suy diễn dao động từ 0.8% đến 1.6%. Sự sai khác cụ thể đƣợc thể hiện ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. cho thấy ở giống đậu tƣơng SL2 và AF516879 có mức tƣơng đồng là 99.2%. khác nhau ở 3 vị trí (190. 216. 241). Giữa SL2 và SL4 có mức độ tƣơng đồng là 98.4%. khác nhau ở 6 vị trí (91. 93. 179. 184. 190. 216); SL4 và AF516879 có mức độ tƣơng đồng là 98.4% khác nhau ở 6 vị trí acid amine (91. 93. 179. 184. 216. 241).
Bảng 3.6. Vị trí sai khác trong trình tự acid amine của protein do gen
GmEXP1 mã hóa ở 3 giống đậu tƣơng
STT Vị trí AF516879 SL2 SL4 1 91 D D N 2 93 R R K 3 179 S S T 4 184 A A P 5 190 V A V 6 216 L L M 7 241 V A A
Từ kết quả phân tích trên chúng tôi khẳng định đã nhân bản. tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen
GmEXP1 ở hai giống đậu tƣơng SL2 và SL4.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.1. Bộ rễ của năm giống đậu tƣơng nghiên cứu có phản ứng khác nhau qua các thời điểm gây hạn. thể hiện ở kích thƣớc rễ. Kích thƣớc rễ có xu hƣớng tăng lên khi cây bị hạn. Kích thƣớc rễ của giống đậu tƣơng SL4 có trị số lớn nhất. tiếp đó là hai giống ĐVN14 và Đ8 và cuối cùng là SL2 và DT84.
1.2. Đã nhân bản. tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ hai giống đậu tƣơng SL2 và SL4.
Đoạn mã hóa của gen GmEXP1 có kích thƣớc 768bp mã hóa 255 acid amine. 1.3. Trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen GmEXP1 ở giống SL2 và SL4
có sự sai khác ở 3 vị trí nucleotide và sai khác ở 5 vị trí acid amine trong polypeptit suy diễn EXP1. So với trình tự mang mã số AF516879 trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI). trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen GmEXP1
của giống đậu tƣơng SL2 và SL4 có hệ số tƣơng đồng từ 99,2% đến 99,6%. hệ số sai khác là từ 0,4% đến 0,8%. Trình tự acid amine suy diễn của giống đậu tƣơng SL2 và SL4 có hệ số tƣơng đồng từ 98,% đến 99,%. hệ số sai khác dao động từ 0,8% đến 1,6%.
2. ĐỀ NGHỊ
Sử dụng trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1 phân lập từ giống có sự phát triển bộ rễ tốt nhất trong các giống nghiên cứu làm nguyên liệu thiết kế vector phục vụ chuyển gen nhằm cải thiện khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng chịu hạn kém.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Ngô Thế Dân và cộng sự (1999). Cây đậu tương. Nxb Nông Nghiệp. Hà Nội. 2. Trần văn Điền (2007). Giáo trình Cây đậu tương. Nxb Nông nghiệp. Hà Nội. 3. Nguyễn Huy Hoàng (1992). Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống
đậu tương nhập nội ở Miền Bắc Việt Nam. Luận án PTS.Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng (2011). Phân lập.tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam. Luận án tiến sĩ sinh học .Thái Nguyên.
5. Trần Thị Phƣơng Liên (1999). Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng. chịu hạn ở Việt Nam. Luận án tiến sĩ Sinh học. Viện Công nghệ Sinh học. Hà Nội.
6. Trần Thị Phƣơng Liên (2010). Protein và tính chịu chống chịu ở thực vật. Nxb Khoa học tự nhiên và công nghệ. Hà Nội.
7. Lò Thanh Sơn. Bùi Ngọc Bích. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Chu Hoàng Mậu (2013). “Đặc điểm của gen Expansin phân lập từ giống đậu tƣơng địa phƣơng Việt Nam”. Tạp chí Sinh học 35(1). tr.99-105.
8. Trần Đình Long (2000). Cây đậu tương. Nxb Nông nghiệp. Hà Nội.
9. Chu Hoàng Mậu (2008). Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng. Nxb Đại học Thái Nguyên.
10. Chu Hoàng Mậu. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng. Chu Hoàng Hà. NguyễnVũ Thanh Thanh (2011). Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương. Nxb Đại học Quốc Gia. Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
11. Bray E.A (1997). “Plant responses to water deficit”. Trends Plant Sci. 2
(2): 48-57.
12. Cho H-T.. Cosgrove DJ.. (2000). “ Altered expression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis thaliana”. Proc Natl Acad Sci USA97:9783–9788.
13. Cho H-T.. Kende H. (1998) “Tissue localization of expansins in deepwater rice”. Plant J 15:805–812.
14. Cosgrove DJ.. Li Z.C.. (1993) “ Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles”. Plant Physiol 103:1321–1328.
15. Cosgrove DJ. (1996) “Plant cell enlargement and the action of expansins”. BioEssays 18:533–540.
16. Cosgrove DJ.. (1997)“ Group I allergens of grass pollen as cell wall loosening agents. Proe Natl Acad Sci USA 94: 6559 – 6564.
17. Cosgrove DJ. (1999)“Enzymes and other agents that enhance cell wall ex- tensibility. Annu Rev plant physiol Plant Mol Biol 50 : 391- 417.
18. Cosgrove D.J.. (2000a) “ Expansive growth of plant cell walls”. Plant
Physiol Biochem 38:109–124.
19. Cosgrove D.J.. (2000b) “ Loosening of plant cell walls by expansins. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nature 407: 321- 326.
20. Fleming A.J.. Caderas D..Wehrli E.. McQueen..Mason S.. Kuhlemeier C.( 1999) “Analysis of expansin-induced morphogenesis on the apical
21. Fleming AJ.. McQueen..Mason S.. Mandel T.. Kuhlemeier C.. (1997“Indu ction of leaf primordia by the cell wall protein
expansin”. Science 276:1415–1418.
22. Fujita Y.. Fujita M.. Satoh R.. Maruyama K.. Parvez M. M.. Seki M.. Hiratsu K.. Ohme-Takagi M.. Shinozaki K.. Yamaguchi-Shinozaki K.. (2005). “AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis”. Plant Cel. 17(12). pp. 3470-88.
23. Guo W.. Zhao J.. Li X.. Qin L.. Yan X..Liao H.. (2011) “ A soybean ß- expansin gene GmEXPB2 intrinsically involved in root system architecture responses to abiotic stresses”. Plant J.. 66(3): 541-52.
24. Hartl F.U.. (1996).“Moleculer chaperones in cellular protein folding”.
Nature. 381. pp. 571- 580.
25. Kam M. J.. Yun H. S.. Kaufman P. B.. Chang S. C.. Kim S. C. ( 2005). “Two expansins. EXP1 and EXPB2. are correlated with the growth and development of maize roots”. J. Plant Physiol.. 48(3): 304-310.
26. Kasper T.C.. Taylor H.M.. and RM. Shibles. 1984. “Taproot elongation rates of Soybean cultivars in the glasshouse and their relation to field rooting depth”. Crop Sci. 24:916-920.
27. Lee D.K.. Ahn J.H.. Song S.K.. Choi Y.D.. Lee J.S. (2003). “Expression of an Expansin Gene Is Correlated with Root Elongation in Soybean”.
Plant Physiology. (131). pp. 985 - 997.
28. Lee D.K.. Ahn J.H.. Song S.K.. Choi SYD.. Lee J.S. (2011). “ Expression of an Expansin gene is corre lated with root elongation in soybean (441-744) ”.
29. Liao Y.. Zou H.F.. Wang H.W.. Zhang W.K.. Ma B.. Zhang J.S.. Chen S.Y.. (2008). “Soybean GmMYB76. GmMYB92. and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Cell Res”.
18(10). pp. 1047–1060.
30. Li X.P.. Tian A.G.. Luo G.Z.. Gong Z.Z.. Zhang J.S.. Chen S.Y.. (2005). “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”. Theor Appl Genet. 110(8). pp. 1355-62.
31. Li Y.. Darley C. P.. Ongaro V.. Freming A.. Schipper O.. Baldauf S. L.. McQueen.Mason S. J..(2002).“ Plant expansins are a comlex multigene family with an ancient evolutionary origin”. J. Plant Physiol..128 (3): 854-864.
32. Link BM. Cosgrove D.J.. (1998) “Acid-growth response and α-expansin in suspension cultures of bright yellow 2tobacco”. Plant Physiol 118:907–916. 33. Reinhardt D.. Wittwer F.. Mandel T.. Kuhlemeier C.. (1998)“ Localized
upregulation of a new expansin gene predicts the site of leaf formation in the tomato meristem”.Plant Cell 10:1427–1437.
34. Tran L.S.. Nakashima K.. Sakuma Y.. Osakabe Y.. Qin F.. Simopson S. D.. Maruyama K.. Fujita Y.. Shinozaki K.. Yamaguchi – Shinozaki K.. (2007). “Co-expression of the stress- inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in