3. Nội dung nghiên cứu
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
Ba giống đậu tƣơng do Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam và hai giống do Trung tâm khuyến nông tỉnh Sơn La cung cấp đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu (Bảng 2.1 và Hình 2.1).
Bảng 2.1. Nguồn gốc các giống đậu tƣơng nghiên cứu
STT Tên giống Nguồn gốc và nơi cung cấp Đặc điểm
1 DT84 Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp
Giống quốc gia. Khả năng đâm xuyên của rễ không tốt.
2 SL2 Trung tâm Khuyến nông Sơn La Giống địa
phƣơng. Khả
năng đâm
xuyên của rễ kém.
3 ĐVN14 Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp
Giống quốc gia. Khả năng đâm xuyên của rễ tƣơng đối tốt 4 Đ8 Trung tâm Nghiên cứu và phát
triển Đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực
Giống quốc gia. Khả năng
và Cây thực phẩm- Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp
đâm xuyên của rễ kém.
5 SL4 Trung tâm Khuyến nông Sơn La Giống địa
phƣơng, chịu hạn tốt, rễ có khả năng đâm xuyến tốt DT84 SL2 ĐVN14 Đ8 SL4
Hình 2.1. Hình ảnh hạt của các giống đậu tƣơng nghiên cứu
Các vector và chủng vi khuẩn sử dụng
Vector tách dòng pBT; do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
Hoá chất
Trizol Reagents Kit của hãng Invitrogen dùng tách chiết RNA; Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen dùng tách chiết Plasmid; Các enzyme hạn chế của hãng Fermentas (Hàn Quốc). Marker, TAE 1X, Tris HCl, MgCl2, EDTA, cloroform , Isoamyl, NaCl, Isopropanl, Ethanol70%, IPTG, agarose,
DEPC0.01%, nƣớc khử ion ...
Kháng sinh Cabenicillin: cơ chất X- gal và các hóa chất cần thiết theo các bộ kit đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosytem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini – transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển) máy vortex (Mimeshaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed – Vac 110A (Savant, Mỹ), máy li tâm, đĩa petri, ống eppendop các loại và nhiều trang thiết bị khác phục vụ trong quá trình thực nghiệm đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài luận văn đƣợc thực hiện tại Bộ môn Di truyền &Sinh học hiện đại, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên. Các thí nghiệm tiến hành tại Phòng thí nghiệm Di truyền &Công nghệ gen, Khoa Sinh –KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm và Phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên; tại Phòng Công nghệ ADN & ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia
về công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đánh giá khả năng kéo dài rễ của cây đậu tƣơng ở giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non
Phƣơng pháp đánh giá khả năng kéo dài ở giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Hạt đậu tƣơng gieo vào các chậu chứa cát sạch kích thƣớc 50 x 25cm mỗi chậu trồng 30 cây cho mỗi giống. Chỉ ngày đầu tƣới nƣớc cho đủ ẩm, khi hạt đậu tƣơng nảy mầm đƣợc 5 ngày tuổi thì tiến hành đo chiều dài mầm ở mỗi giống. Khi cây đậu tƣơng có lá mầm (8 ngày tuổi) cây có 1 lá thật thì đo chiều dài rễ của mỗi giống.
2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.1.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số 2.2.1.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Phƣơng pháp tách RNA bằng sử dụng bộ Kit Trizol Reagents của hãng
Invitrogen để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu rễ mầm đậu tƣơng, tách chiết RNA tổng số phải đƣợc vô trùng tuyệt đối. Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bƣớc nhƣ sau:
- Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
- Bổ sung 1ml Trizone Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
- Thêm 200 µl C: I ( 24 cloroform : 1 Isoamyl), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Ly tâm 10.000 vòng/15 phút/40C.
- Thu 500 µl dịch nổi và cho vào ống eppendorf loại 1,5ml
- Thêm 500 µl Isopropanol 40 C cho vào ống, đảo đều 15 phút ở 250C. Li tâm 10.000 vòng/15 phút.
- Thu tủa cặn đáy của ống eppendorf (làm nhẹ nhàng tránh làm mất RNA). - Bổ sung 700 µl cồn 70%, li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa , thực hiện hai lần.
- Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendorf trong box vô trùng khoảng 15-20 phút.
- Bổ sung 50 µl trong nƣớc DEPC 0.01%, ủ ở nhiệt độ 550 C trong 15 phút cho tan RNA.Vortex để RNA hòa tan hoàn toàn.
- Điện di kiểm tra RNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%- 1% trong TAE 1X. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sang cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong các mẫu đã tách.
2.2.1.2. Phƣơng pháp nhân đoạn mã hóa của gen GmEXP 1
Từ RNA tinh sạch tiến hành tạo cDNA và nhân bản gen GmEXP1 bằng kỹ thuật PCR với mồi đặc hiệu SoyExp-F/SoyExp-R có trình tự đƣợc trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi nhân đoạn mã hóa của gen GmEXP1
Ký hiệu mồi Trình tự mồi (5’-3’)
SoyExp-F CATGCCATGGATGGGCAAAATCATGCTTGT
SoyExp-R ATTTGCGGCCGCTTAGTGAACTGGGCTAGA
Kit và hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA thể hiện ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích
1 RNA tổng số 5 µl
2 Primese ranolome hexamine 1 µl
3 DEPC Water 6 µl
Tổng 12 µl
- Tiến hành ủ mẫu ở 650C trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá lạnh. - Bổ sung: Reaction Buffer 4 µl; ReboleckTM RnaseTrizone Regents 1 µl; dNTP Mix 2 µl; RT (Reverse Transcriptase emzym: Enzym sao chép ngƣợc) 1 µl. - Mẫu đƣợc cho vào máy PCR và cài đặt chu kỳ nhiệt cho phản ứng: 250C/15 phút; 420C/60 phút; 700C/5 phút.
- Sau phản ứng tổng hợp cDNA tiếp tục thực hiện khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp-F/SoyExp-R. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR (Bảng 2.4 và Bảng 2.5).
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nƣớc khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2.5µl 3 MgCl2 (25mM) 2µl 4 dNTPs (10mM) 2.5µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1µl
6 Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 1µl
7 Taq DNA polymerase ( 5 đơn vị/ µl) 1µl
8 cDNA khuôn ( 10 – 20 ng/µl) 2µl
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
30
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
- Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose1% trong TAE 1X với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím, mẫu đạt yêu cầu thì bảo quản.
Mẫu DNA thu đƣợc từ phản ứng RT- PCR cần phải đƣợc tinh sạch (thôi gel) để chuẩn bị cho tách dòng.
2.2.1.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas thực hiện nhƣ sau:
- Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1% với sự có mặt của marker chuẩn và cắt lấy băng DNA quan tâm có kích thƣớc khoảng 0,77 Kb cho vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung Binding Buffer với gel đã cắt theo tỉ lệ 1:1, ủ ở 550C trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn tạo dịch trong suốt.
- Chuyển sản phẩm sang ống eppendorf màng lọc đáy (cột lọc tím), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây sau đó bỏ dịch đáy.
- Bổ sung 700 µl Wash buffer, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Chuyển cột lọc tím sang ống eppendorf loại 1.5 ml, mở nắp trong vòng 5 phút.
- Bổ sung 40 µl nƣớc khử ion, ủ mẫu ở 550C trong 5 phút, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây.
- Bỏ cột lọc, thu dịch đáy bảo quản.
- Kiểm tra sản phẩm thôi gel bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Mẫu đạt yêu cầu bảo quản và sử dụng cho tách dòng gen.
2.2.1.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đã tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Thành phần cho phản ứng đƣợc thể hiện ở Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Thể tích 1 cDNA 7 µl 2 Ligation buffer 10X 1 µl 3 Vector pBT 1 µl 4 Enzym T4 ligase 1 µl Tổng 10 µl
Hỗn hợp thu đƣợc từ phản ứng ligation đƣợc ủ ở 220C trong khoảng 2 giờ, sau đó sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT
2.2.1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Tế bào khả biến đƣợc lấy từ trong tủ - 850C chuyển sang môi trƣờng
-40C khoảng 20 phút (bình đá).
Biến nạp:
- Bổ sung 5 µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. - Hỗi hợp đƣợc đặt trong bình đá 15 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút 30 giây, sau đó chuyển nhanh hỗn hợp vào đá lạnh( sốc nhiệt) trong 5 phút .
- Bổ sung 500 µl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) cho vào hỗn hợp.
- Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.
Cấy trải tế bào biến nạp trên môi trƣờng LB đặc
- Đổ thạch môi trƣờng cấy trải (X-gal: 50 µl; IPTG: 50 µl; carbenicillin: 50µl; LB đặc: 500µl) vào đĩa thủy tinh hoặc nhựa.LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose).
- Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút,bỏ dịch nổi giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng môi trƣờng cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng:
- Chọn các khuẩn lạc trắng đem nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000LB lỏng: 1carbenicillin). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng /phút, trong 16 giờ.
2.2.1.6. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
Lấy dịch nuôi lỏng chứa vi khuẩn đã biến nạp, đem kiểm tra sản phẩm các mẫu đã chọn dòng bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi SoyExp-F/SoyExp-R. Đây là cặp mồi đƣợc thiết kế chung cho các vector tách dòng, nó nằm trên vector và nhân đoạn gen vừa biến nạp.
Thành phần phản ứng colony-PCR thể hiện ở bảng 2.7. Bảng 2.7. Thành phần phản ứng colony – PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nƣớc khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2,5µl 3 MgCl2 ( 25mM) 2µl 4 dNTPs ( 10mM) 2,5µl
5 Mồi SoyExp-F (10pmol/µl) 1µl
6 Mồi SoyExp-R (10pmol/µl) 1µl
7 cDNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2µl
8 Taq DNA polimerase (5 đơn vị/µl) 1µl
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
30
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.1.7. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen. Cụ thể có sự tham gia của 3 loại hóa chất:
Sol I (50 mM glucose, 25mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH8) Sol II (0,2M NaOH, SDS 1%)
Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O)
Quy trình tách plasmid
- Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa cặn trong 100µl Sol I đảo đều cho tan cặn. Bổ sung 200 µl Sol II, đảo nhẹ.
- Bổ sung 150µl sol III đảo nhẹ.
- Bổ sung C: I (24 cloroform: 1 Isoamyl), đảo nhẹ. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu dịch nổi.
- Ly tâm 13000 vòng/phút/ 40 C, trong 10 phút, sau đó thu tủa.
- Bổ sung 500µl cồn lạnh 70% lắc nhẹ, ly tâm 13000vòng/phút trong 10 phút, sau đó thu tủa.
- Làm khô mẫu trong hộp, bổ sung nƣớc 40 µl RNAase, ủ 370 trong 30 phút.
- Điện di kiểm tra kết quả tách plasmid trên gel agarose 1% trong TAE 1X với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.3. Phƣơng pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen GmEXP1 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Phân tích trình tự gen GmEXP1 bằng phần mềm DNAstar và BioEdit.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU
Sau một ngày hạt trƣơng nƣớc và hình thái hạt nảy mầm ở ngày thứ ba đƣợc thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh hạt của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn hạt nảy mầm 3 ngày tuổi (1: DT84, 2: Đ8; 3: SL2 ; 4: ĐVN14; 5: SL4)
So sánh sức nảy mầm của 5 giống đậu tƣơng cho thấy, ở giai đoạn hạt nảy mầm 2 ngày tuổi, hai giống đậu tƣơng SL4 và ĐVN14 có tỷ lệ hạt nảy mầm là 80%, hai giống SL2 và Đ8 là 60% và giống DT84 là 20%. Chiều dài mầm giữa các giống là khác nhau, giống SL4 có mầm dài nhất trong 5 giống, tiếp đến là ĐVN14, SL2, Đ8 và cuối cùng là DT84.
Ở giai đoạn hạt nảy mầm 3 ngày tuổi, cả 5 giống đậu tƣơng xuất hiện lá mầm và rễ bắt đầu phát triển. Kết quả so sánh chiều dài rễ của 5 giống đậu tƣơng ở giai đoạn hạt nảy mầm 5 ngày tuổi đƣợc trình bày ở Hình 3.2 và Bảng 3.1.
Hình 3.2. Rễ của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn hạt nảy mầm 5 ngày tuổi (giai đoạn lá mầm)
Bảng 3.1. Kích thƣớc rễ của 5 giống đậu tƣơng ở giai đoạn hạt nảy mầm 5 ngày tuổi (giai đoạn lá mầm) Đơn vị: cm; n ≤ 30
DT 84 Đ8 SL2 ĐVN14 SL4
13,92 ± 0,77 14,70 ± 1,59 16,27 ± 0, 73 17,44 ± 0,35 19,27 ± 0,58
Giai đoạn hạt nảy mầm 5 ngày tuổi, số liệu ở Bảng 3.1 cho thấy sự kích thƣớc rễ của 5 giống đậu tƣơng là khác nhau, giống SL4 có kích thƣớc rễ trung bình dài nhất (19,27cm), ngắn nhất là giống DT84 (13,92cm).
Bảng 3.2. Kích thƣớc rễ của 5 giống đậu tƣơng ở giai đoạn 1 lá thật Đơn vị: cm; n ≤ 30
DT84 Đ8 SL2 ĐVN14 SL4
15,64 ± 1,27 14,56 ± 0,56 17,82 ± 0,88 20,53 ± 1,73 24,00 ± 2,88
Chuyển sang giai đoạn xuất hiện một lá thật (8 ngày tuổi) rễ chính phát triển chậm lại so với giai đoạn lá mầm 5 ngày tuổi. số lƣợng rễ con nhiều và kích thƣớc rễ con cũng tăng rất nhanh. Giống đậu tƣơng SL4 có kích thƣớc rễ dài nhất (24,00cm), sau đó đến ĐVN14, SL2, Đ8 và cuối cùng là giống DT84 (15,64).
Hình 3.3. Rễ của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn 1 lá thật (8 ngày tuổi)
Nhƣ vậy từ kết quả quan sát có thể kết luận rằng. ở giai đoạn nảy mầm 2 ngày tuổi. giai đoạn lá mầm 5 ngày tuổi và giai đoạn 1 lá thật 8 ngày tuổi giống đậu tƣơng địa phƣơng SL4 có bộ rễ phát triển mạnh nhất. giống DT84 là giống có bộ rễ phát triển kém nhất.
3.2. TRÌNH TỰ ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG SL2 VÀ SL4 HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG SL2 VÀ SL4
3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ rễ mầm của 5 giống đậu tƣơng Từ 5 giống đậu tƣơng chúng tôi lấy rễ mầm để tiến hành tách chiết