III Nguồn thu nhận carotenoid và tổng hợp carotenoid ở nấm sợ
4.Phơng pháp nghiên cứu
4.1. Phơng pháp vi sinh
Môi trờng giữ giống và môi trờng nhân giống
+Môi trờng giữ giống
Nguyên tắc: Giống đợc bảo quản trong cát vô trùng (cát vàng sàng qua rây) đã xử lý bằng hoá chất. Mục đích là để rửa sạch và loại bỏ tạp chất kim loại bằng nam châm, sau khi cát đợc làm sạch cho cát vào trong ống nghiệm có nút xoáy thanh trùng, sấy ở nhiệt độ 60 0 C cuối cùng cấy giống cần bảo quản vào trong ống cát ở trong điều kiện vô trùng. Sấy ống giống ở nhiệt độ 370C trong 2 ngày mục đích làm khô cát khi ta cấy giống vào. Giống đợc bảo quản trong tủ lạnh ở 40C và giống đợc cấy chuyền lại sau 6 - 8 tháng.
+ Môi trờng hoạt hoá giống
Nấm mốc đợc nuôi trong ống nghiệm thạch nghiêng hoặc bình tam giác 250 ml hoặc bình tam giác 500 ml có chứa 10 ml môi trờng PDA hoặc PSA (đối với ống nghiệm) và 50 ml môi trờng PDA hoặc PSA (đối với bình tam giác), nuôi ở 270C - 280C trong 3 - 5 ngày.
+ Môi trờng lên men (sử dụng phơng pháp nuôi cấy chìm)
Sau khi hoạt hoá giống, khi giống đã lên đen và phủ đầy mặt thạch, ta tiến hành theo các bớc:
− Hút 5 ml nớc cất thanh trùng (đối với ống nghiệm giống) hoặc 20 ml n- ớc cất thanh trùng (đối với bình tam giác) cho vào ống hoặc bình giống có chứa giống đã đợc hoạt hoá để rửa và thu bào tử.
− Soi kính hiển vi để xác định hình thái bào tử và đếm số lợng bào tử của từng chủng riêng rẽ có trong 1 ml dung dịch huyền phù.
X = 2.5 x a x f x105 (BT/ml)
X: số bào tử có trong 1 ml canh trờng a: số bào tử (trung bình trong 1ô to) f: hệ số pha loãng
− Sử dụng bào tử vừa thu đợc tiếp vào môi trờng lên men. − Lắc 250 vòng/phút, nuôi ở 280C trong 3 - 5 ngày.
+ Chuẩn bị giống cấp 1 chủng 5989.
− Hút 5 ml nớc cất thanh trùng vào ống thạch nghiêng chứa giống đã đợc hoạt hoá.
Các bớc tiếp theo tiến hành nh trên.
− Lắc 250 vòng/phút, nuôi ở 280C trong 24 giờ.
4.2. Phơng pháp phối giống.
+ Phối WH1 và WH2.
Sau khi rửa, thu bào tử và đếm số lợng bào tử nấm của từng chủng riêng rẽ, tiến hành phối hai chủng với các tỉ lệ phối khác nhau, sau đó tiếp giống vào môi trờng lên men.
+ Phối 5989 và WH2 .
Giống cấp 1 của chủng 5989 (giống sau khi đã đợc lên men cấp 1 một ngày) sẽ đợc phối với dịch huyền phù của chủng WH2 theo các tỉ lệ phối khác nhau, sau đó tiếp giống vào môi trờng lên men.
Tỷ lệ phối giống thích hợp đánh giá dựa vào các thông số: - Xác định hình thái hệ sợi.
- Hàm lợng sinh khối nấm chứa β-carotene tạo thành (gam sinh khối khô/ lit môi trờng).
- Lợng β-carotene tạo thành.