Phƣơng pháp xử lý mẫu thực phẩm

1.4.1. Nguyên tắc xử lý mẫu

Xử lý mẫu là quá trình hoà tan và phá huỷ cấu trúc của chất mẫu ban đầu, giải phóng và chuyển các chất cần xác định về dạng đồng thể phù hợp với phép đo đã chọn, từ đó xác định hàm lƣợng chất mà chúng ta mong muốn.

Ngày nay theo sự phát triển của khoa học, của ngành hóa học và các ngành kỹ thuật, các phƣơng pháp và các loại trang bị, dụng cụ để xử lý mẫu phân tích cũng đƣợc phát triển và hoàn thiện không ngừng, có nhiều tiện lợi và đảm bảo đƣợc tốt các yêu cầu của phân tích. Các kỹ thuật xử lý mẫu đã đang và sẽ đƣợc dùng đó là: Kỹ thuật vô cơ hóa khô ( xử lý khô), kỹ thuật vô cơ hóa ƣớt ( xử lý ƣớt), kỹ thuật vô cơ hóa khô ƣớt kết hợp: là phƣơng pháp kết hợp 2 phƣơng pháp trên, các kỹ thuật chiết ( lỏng-lỏng, rắn-lỏng, rắn-khí....), Các kỹ thuật sắc ký.

Khi xử lý mẫu để xác định kim loại thì ngƣời ta thƣờng xử lý mẫu theo 3 phƣơng pháp đầu (khô, ƣớt và khô ƣớt kết hợp).

22

Phá mẫu hệ hở

Phƣơng pháp này đơn giản, không cần dụng cụ phức tạp và cho kết quả khá chính xác.

Các axit đƣợc sử dụng trong phá mẫu hệ hở nhƣ: HF, HCl, H2SO4, HClO4…, tùy theo loại mẫu và nguyên tố cần phân tích mà ta có quy trình phân tích phù hợp. Ví dụ nhƣ để xác định các nguyên tố dễ bay hơi nhƣ Hg thì cần khống chế nhiệt độ < 1200C, để phá các mẫu chứa nhiều SiO2 cần cho thêm HF….

Phá mẫu hệ kín :

Hiện nay phổ biến nhất là kỹ thuật xử lý mẫu ƣớt với axit đặc trong lò vi sóng hệ kín do có nhiều ƣu điểm nhƣ: thời gian xử lý mẫu ngắn, phá huỷ mẫu triệt để và không mất chất phân tích, hiệu suất xử lý mẫu cao.

Dƣới tác dụng phá hủy và hoà tan các hạt (phần tử) mẫu của axit, năng lƣợng nhiệt cùng axit làm tan rã các hạt mẫu đồng thời do khuếch tán, đối lƣu, chuyển động nhiệt và va chạm của các hạt mẫu với nhau làm chúng bị bào mòn dần, các tác nhân này tấn công và bào mòn dần các hạt mẫu từ bên ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần và tan hết.

Ngoài ra, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu do các phân tử nƣớc hấp thụ (> 90%) năng lƣợng vi sóng và do có động năng lớn nên chúng chuyển động nhiệt rất mạnh, làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Hơn nữa, do xử lý mẫu trong hệ kín nên áp suất cao sẽ làm nhiệt độ sôi cao hơn, đây là tác nhân phân huỷ mạnh nhất do vậy thúc đẩy quá trình phân huỷ mẫu từ bên trong ra và từ ngoài vào. Do đó, xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian rất ngắn 50 đến 90 phút và rất triệt để.

1.4.2. Một số phƣơng pháp xử lý mẫu thực phẩm xác định hàm lƣợng kim loại nặng

Tác giả M. Lucila Lares, Gilberto Flores-Munozb, Ruben Lara-Lara [31] đã nghiên cứu đánh giá những biến đổi theo thời gian về hàm lƣợng Cd, Al, Hg, Zn, Mn theo các tháng trong trai và trong rong biển đƣợc nghiên cứu tại khu bờ đá tại Vịnh San Quintin, Baja Califonia,Mexico. Kết quả cho thấy mối liên quan giữa điều

23

kiện thời tiết, thuỷ văn và các bộ phận trong cơ thể con trai bằng cách phân tích tƣơng quan và phƣơng pháp phân tích thành phần chính (PCA).Tác giả đã đƣa ra phƣơng pháp xử lý mẫu nhƣ sau: Mẫu trai đƣợc xử lý sạch và rửa bằng nƣớc cất sau đó cho vào cốc sạch sấy ở 700C đến khối lƣợng không đổi. Sau đó cân khoảng 1g mẫu khô thêm lƣợng HNO3 xác định để phân huỷ mẫu sau đó cho thêm H2O2 để phá huỷ hoàn toàn lƣợng lipit khó tan. Đối với phá mẫu xác định thuỷ ngân sau khi phá mẫu bằng hỗn hợp HNO3 và H2SO4 tỉ lệ 2:1 cho thêm hỗn hợp KMnO4 , H2O2.

Tác giả Locatelli [30] đã dùng hỗn hợp H2SO4 và HNO3 phân hủy mẫu trai, ốc, cá để xác định các vết kim loại thông thƣờng. Để xác định Hg bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử hóa hơi lạnh (CV – AAS) hỗn hợp H2SO4 và K2Cr2O7 đƣợc sử dụng. Quy trình tỏ ra đơn giản, an toàn , mẫu phân hủy tốt

M.G.M Alam, E.T.Snow, A Tanaka đã phá mẫu các loại rau nhƣ bí ngô, khoai môn, đu đủ để xác định các kim loại nặng trong mẫu đƣợc trồng ở làng Samta, Bangladesh bằng HNO3 và HF. Mẫu sau khi phân huỷ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ICP-MS thu đƣợc các kết quả về nồng độ trung bình các kim loại nặng (μg/g) là: As (0,17);Cd (0,023); Cr (0,07); Cu (3,5); Co (0,02); Fe (12,7); Mn (34,70; Pb (4,5); Zn (25,2) .[ 33]

Các tác giả F.Queirolo, S.Stegen, M.Restovic, M.Paz, P.Ostapczuk, M.J.Schwuger, L.Munoz đã dùng HNO3 đặc và HClO4 đặc theo tỷ lệ về thể tích là 4:1 để phá các mẫu lƣơng thực nhƣ ngô, khoai tây, hành, đậu để xác định Pb, Cd. Mẫu sau khi phá đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ICP-MS thu đƣợc nồng độ của Cd từ 0,56 -3,9 ng/g và của Pb là từ 0,6-25,4 ng/g.[23]

Xử lý mẫu rau quả bằng hỗn hợp axit HNO3 và H2O2 trong bình Kendal để xác định các kim loại nặng Cd, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn: Lấy 5,00 g mẫu đã nghiền mịn và trộn đều vào bình Kendal, thêm 60 ml HNO3 65%, 5 ml H2O2 30%, cắm phễu nhỏ vào bình Kendal, lắc đều và đun sôi nhẹ cho mẫu phân hủy, đến khi đƣợc dung dịch không màu (6 – 8 giờ tùy loại mẫu). Chuyển mẫu sang cốc 250 ml, làm bay hơi hết axit bằng đèn IR đến còn muối ẩm, để nguội, định mức bằng dung dịch axit HCl 2% thành 25 ml. Trong quá trình xử lý này các nguyên tố kim loại ở dạng các hợp

24

chất cơ kim của mẫu rau quả sẽ bị axit đặc oxy hóa các chất hữu cơ, đƣa các kim loại về muối vô cơ tan trong dung dịch nƣớc. Qúa trình hóa học chính:

Mẫu +HNO3 + H2O2 → Me(NO3)m + H2O + CO2+ NO2 (muối tan của kim loại )

Tro hóa khô mẫu rau quả để xác định các kim loại (Na, K, Ca, Mg, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn). Cân 5,00 g mẫu đã nghiền mịn vào chén thạch anh, đem sấy từ từ cho đến khi mẫu khô đen, rồi đem nung ở nhiệt độ 450oC sau đó nâng lên 550oC cho đến khi mẫu hết than đen sẽ đƣợc tro trắng. Sau đó hóa tan tro thu đƣợc trong 12 – 15 ml dung dịch HCl 18% và có 0,5 ml HNO3, đun nhẹ cho tan hết, đuổi hết axit dƣ đến còn muối ẩm và định mức thành 25 ml bằng dung dịch HCl 2%. Các nguyên tố Cd, Cu, Pb, Zn sẽ bị mất một ít (10-15%) khi nung. Cách này thích hợp cho xác định các kim loại kiềm, kiềm thổ và Fe, Mn, Ni.

25

Chƣơng 2-THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu.

2.1.1. Đối tƣợng:

Trong bản luận văn này đối tƣợng nghiên cứu là các mẫu rau, củ, quả, thịt và nội tạng động vật. Do không có điều kiện để phân tích mẫu đại diện nên chúng tôi chỉ phân tích các mẫu ngẫu nhiên (các mẫu đƣợc mua ở chợ về). Phân tích tổng hàm lƣợng kim loại nặng trong toàn bộ mẫu sau khi đã bỏ các phần không ăn đƣợc đi.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

+ Tối ƣu hoá điều kiện phân tích đồng thời các kim loại nặng bằng phƣơng pháp ICP-MS.

+ Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu thực phẩm để phân tích hàm lƣợng các kim loại nặng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

+ Phân tích đánh giá hàm lƣợng kim loại nặng trong một số mẫu thực phẩm

2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.2.1. Hóa chất

+ Tất cả các hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA) hoặc tinh khiết thuốc thử (PR) và đƣợc pha chế bằng nƣớc cất hai lần.

+ Nƣớc sạch cấp thuốc thử (nƣớc siêu sạch): Nƣớc cất đƣợc cho qua hệ trao đổi ion hay qua thiết bị lọc đạt tiêu chuẩn ICP-MS, LC và có trở kháng nhỏ hơn 18M.

+ Dung dịch chuẩn gốc chứa đồng thời các ion của các nguyên tố cần phân tích (trừ Hg) nồng độ 10 ppm trong môi trƣờng axit HNO3 2% và dung dịch chuẩn đơn của Hg nồng độ 10 ppm trong môi trƣờng axit HNO3 2%

Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn đƣợc pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc trong môi trƣờng HNO3 2%.

+ Các loại axit đặc, tinh khiết: HNO3, HCl, H2SO4 và H2O2 đặc. + Các loại hoá chất cơ bản khác.

26

+ Hệ thống ICP – MS (Model ELAN 9000 – Perkin Elmer) và các thiết bị phụ trợ (hình 2)

+ Tủ sấy, tủ hút, bếp điện

+ Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 gam; cân kỹ thuật có độ chính các 0,1 gam

+ Bộ dụng cụ phá mẫu bằng ống teflon có bọc inox ở ngoài (sẽ trình bày chi tiết ở chƣơng 3)

+ Máy nƣớc cất 1 lần, 2 lần

+ Pipet các loại: 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10 ml + Bình Kendal các loại 50; 100 ml

+ Bình định mức các loại: 25; 50; 100 ml.

Hệ trang bị của phép đo ICP-MS

Hệ máy đo ICP-MS bao gồm các bộ phận chính sau, và đƣợc chỉ ra trên hình 2.1:

Hình 2.1: Hệ trang bị ICP-MS 1. Bộ tạo sol khí

2. Plasma 3. Hệ lăng kính

4. Van ngăn cách giữa vùng chân không cao của phổ kế và vùng ion 5. Lăng kính ion

27

6. Bộ phân giải khối 7. Detector

Hình ảnh thiết bị phân tích ICP-MS đƣợc sử dụng để phân tích mẫu tại khoa Hoá- Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Hình 2.2:Hình ảnh máy ICP – MS (ELAN 9000)

2.3. Lấy mẫu, bảo quản mẫu. 2.3.1. Lấy mẫu 2.3.1. Lấy mẫu

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng kim loại trong 3 đối tƣợng.

+ Rau xanh và một số loại củ quả + Thịt : thịt gà và thịt lợn

+ Nội tạng động vật: gan lợn

Những mẫu này chúng tôi mua ở chợ Vạn Kiếp, quận Hoàn Kiếm, thành phố Hà Nội vào ngày 15 tháng 9 năm 2011, sau đó xử lý sơ bộ và bảo quản nhƣ trình bày ở phần 2.3.2 dƣới đây.

2.3.2. Xử lý mẫu sơ bộ và bảo quản mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Mẫu rau, củ, quả: Mẫu mua về nhặt bỏ những phần không ăn đƣợc,rửa sạch bằng nƣớc máy sau đó tráng lại bằng nƣớc cất 1 lần rồi nƣớc cất 2 lần, để ráo nƣớc,

28

hong cho hết nƣớc bám vào. Sau đó đem sấy khô tới khối lƣợng không đổi trong tủ sấy ở nhiệt độ 60o

C.

Mẫu thịt và gan lợn: mua về rửa sạch và tráng bằng nƣớc cất 1 lần rồi nƣớc cất 2 lần, thấm khô nƣớc. Sau đó xay nhỏ rồi đem sấy tới khối lƣợng không đổi trong tủ sấy ở nhiệt độ 60oC.

Các mẫu trên sau khi đã sấy khô đƣợc nghiền thành bột mịn,bảo quản trong bình hút ẩm. Xác định hàm lƣợng nƣớc trong mẫu theo công thức sau

sww sdw

dw%  100

Trong đó : dw % là hàm lƣợng khô của mẫu

sdw là khối lƣợng của mẫu sau khi sấy khô ( g ) sww là khối lƣợng của mẫu tƣơi ( g )

Ta có bảng hệ số dw% của các mẫu nhƣ sau

Bảng 2.1: Hệ số dw% của các mẫu STT Mẫu sww (g) sdw (g) dw (%) 1 Bắp cải 230 21,4 9,30 2 Bí ngô 200 29,1 14,50 3 Mƣớp đắng 230 15,8 6,87 4 Rau muống 250 23,2 9,28 5 Cà rốt 265 25,7 9,88 6 Rau ngót 150 28,6 19,07 7 Khoai tây 350 71,8 20,51 8 Xu xu 350 25,8 7,37

29

9 Rau cần 240 19,6 8,17 10 Gan lợn 170 50,2 29,53 11 Thịt lợn 200 52,1 26,05 12 Thịt gà 200 55,4 27,70

30

Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện phân tích bằng phƣơng pháp ICP-MS 3.1.1. Chọn đồng vị phân tích 3.1.1. Chọn đồng vị phân tích

Trong tự nhiên, các nguyên tố có một số đồng vị. Trong phép phân tích bằng ICP-MS ngƣời ta thƣờng chọn đồng vị dựa trên ba tiêu chí:

+ Phải là một trong những đồng vị phổ biến nhất trong tự nhiên + Ảnh hƣởng bởi sự chèn khối phải không có hoặc bé nhất

+ Sự hiệu chỉnh ảnh hƣởng của các mảnh ion oxit phải đơn giản và càng ít bƣớc càng tốt.

Tuỳ theo sự phức tạp của nền mẫu mà có thể chọn các đồng vị phân tích khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các tác giả đều thống nhất trong việc lựa chọn số khối phân tích này chỉ trừ một vài trƣờng hợp đặc biệt . Trong đề tài này chúng tôi lựa chọn các đồng vị nhƣ bảng 3.1

Bảng 3.1: Số khối và tỉ lệ đồng vị đối với các nguyên tố phân tích STT Nguyên tố phân tích Số khối (m/z) Tỉ lệ đồng vị (%) 1 Cr 52 83,79 2 Mn 55 100 3 Fe 57 2,12 4 Co 59 100 5 Ni 60 26,22 6 Cu 63 69,17 7 Zn 65 27,90 8 As 75 100 9 Cd 114 28,73 10 Hg 202 29,86 11 Pb 208 52,40

31

Khi phân tích, máy chỉ thu tín hiệu của các đồng vị đã chọn theo nguyên tắc phân giải khối bằng bộ phân chia tứ cực.

3.1.2. Độ sâu mẫu (Sample Depth - SDe):

SDe là khoảng cách giữa đỉnh cone giao diện đến bên phải vòng dây tạo plasma (đƣợc biểu diễn trong hình 3.1).

Hình 3.1: Giá trị SDe

SDe có ảnh hƣởng đến nhiều đại lƣợng trong đó có cƣờng độ vạch phổ. Khi tăng giá trị SDe cƣờng độ vạch phổ giảm dần. Kết quả cho thấy khi công suất cao tần RF lớn từ 1200W trở lên thì cƣờng độ vạch phổ giảm nhanh hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Trong phép phân tích chúng tôi chọn độ sâu mẫu là 3 mm.

3.1.3. Công suất cao tần (Radio Frequency Power - RFP):

Với mục đích xác định đồng thời lƣợng vết và siêu vết 11 ion kim loại nặng trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp ICP-MS thì việc khảo sát ảnh hƣởng của công suất cao tần (RF) là rất cần thiết. Tiến hành tối ƣu thông số này ở chế độ tự động sử dụng dung dịch hỗn hợp 11 nguyên tố Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, As, Cd, Pb nồng độ 5 ppb và Hg 2 ppb, Fe 10 ppb trong HNO3 2%.

32

Hình 3.2: Ảnh hƣởng của công suất cao tần

Các kết quả khảo sát ảnh hƣởng của công suất RFP: Khi tăng công suất RFP thì cƣờng độ khối phổ của các ion kim loại Cr, Cu, Mn có xu hƣớng giảm sau đó tăng, xuất hiện cực đại trong khi tín hiệu phổ của Co, Ni tăng sau đó giảm và nếu tiếp tục tăng công suất RFP thì lại tăng và đạt cực đại ở 1300W và 1250W. Với các nguyên tố Cd, Hg cƣờng độ tăng liên tục tới khi công suất RFP đạt 1300W sau đó giảm dần nếu tiếp tục tăng công suất RFP trong khi tín hiệu đo As liên tục tăng và tín hiệu của Fe và Zn liên tục giảm đến điểm cuối lại tăng. Đƣờng biểu diễn cƣờng độ vạch phổ của Pb theo công suất RFP dao động liên tục và cực đại ở vùng 1200W. Nhƣ vậy, để xác định đồng thời 11 ion kim loại nặng thì chọn công suất RFP bằng 1200W là thích hợp nhất.

3.1.4. Lƣu lƣợng khí mang (Nebulized gas flow – NGF)

NGF có ảnh hƣởng đáng kể đến độ nhạy của phƣơng pháp ICP-MS. NGF lớn lƣợng mẫu đƣợc đƣa vào vùng plasma lớn và ngƣợc lại. Điều này dẫn đến tỷ lệ tín hiệu trên một đơn vị nồng độ tăng hoặc giảm, dẫn đến ảnh hƣởng độ nhạy của phép phân tích. Tuy nhiên không phải khi tăng NGF là cƣờng độ vạch phổ tăng, hoặc khi giảm NGF là cƣờng độ vạch phổ giảm. Sự tăng hay giảm chỉ nằm trong một phạm

Đồ thị khảo sát công suất RF

0.00 5000.00 10000.00 15000.00 20000.00 25000.00 800.0 900.0 1000.0 1100.0 1200.0 1300.0 1400.0 W Cps Cr Fe Cu Co As Cd Hg Mn Ni Zn Pb

33

vi nhất định và còn tuỳ thuộc vào nhiều thông số khác. Tƣơng tự ta tiến hành tối ƣu thông số này ở chế độ tự động sử dụng dung dịch hỗn hợp 11 nguyên tố Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, As, Cd, Pb nồng độ 5 ppb và Hg 2 ppb, Fe 10 ppb trong HNO3 2%.

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của lƣu lƣợng khí mang

Kết quả nghiên cứu cho thấy khi NGF tăng dần thì tín hiệu đo 11 ion kim loại nặng đều tăng nhƣng nếu NGF quá cao thì cƣờng độ khối phổ lại giảm, nhƣng