- Môi trường phân lập đặ c:
b) Phân lập từ côn trùng bệnh
2.5.2.3. Thử khả năng diệt sâu của các chủng vi khuẩn Bt trong phòng thí nghiệm
nghiệm
Để xác định được độc lực của các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập được đối
với các loại sâu ăn lá cây dưa chuột, dưa hấu Spodoptera litura và sâu ăn lá su
hào, bắp cải Plutella xylostella (đều là những loại sâu là ký chủ đặc hiệu của vi
khuẩn Bt), tôi lần lượt thực hiện các thí nghiệm sau:
Cấy giống và nhân giống cấp 1, cấp 2 trong các bình tam giác chứa 100ml môi trường nhân giống vô trùng đã chuẩn bị từ trước. Tiến hành nhân giống mỗi cấp ở 200 v/p, 28oC trong 24h.
*Thí nghiệm 2: Lên men tạo sinh khối vi khuẩn Bt
Lấy 5ml giống cấp 2 cấy sang các bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường lên men (tỷ lệ tiếp giống 5%). Tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 200 v/p ở 28oC trong 50 – 60h.
* Thí nghiệm 3: Xác định số lượng bào tử/tinh thể độc của vi khuẩn Bt
Do mỗi tế bào của các chủng Bt khi bị phá vỡ giải phóng ra một bào tử và một tinh thể độc. Cho nên bằng cách đếm số lượng bào tử ta có thể ước tính số lượng bào tử có trong dịch lên men, cũng như theo dõi được tốc độ sinh trưởng của chủng Bt đang sử dụng.
Để đếm số lượng bào tử ta tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi
pha loãng mẫu. Lấy 0,1ml ở 3 nồng độ pha loãng cuối cấy gạt vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường đếm số lượng bào tử (mỗi nồng độ 2 đĩa). Để
vào tủ ấm ở 28oC trong 24h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa.
Số lượng bào tử trong 1ml dịch lên men sẽ được tính theo công thức:
X = n.10/a (bào tử/ml)
X: số bào tử trong 1ml dịch lên men. n: số khuẩn lạc trung bình
a: nồng độ pha loãng.
* Thí nghiệm 4: Thử khả năng diệt sâu của các chủng Bt trong phòng thí nghiệm
Để thử hoạt lực diệt sâu của các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập, tôi tiến hành thu hồi dịch lên men tương ứng với từng chủng ở thời điểm thu được nhiều bào tử và tinh thể độc (50 - 60 giờ). Tôi tiến hành pha loãng 3 lần dịch lên men của từng chủng Bt để thử hoạt tính.
Để có cơ sở so sánh và đánh giá hiệu quả diệt sâu của các chủng Bt đã phân lập, tôi bố trí thêm 1công thức đối chứng dương là chế phẩm Bt thương mại được sản xuất bởi một công ty sản xuất thuốc trừ sâu sinh học của Trung Quốc
và 1 công thức công thức đối chứng âm thức ăn được nhúng vào môi trường lên
men vô trùng không có vi khuẩn Bt. Chế phẩm có dạng thuốc bột, chứa chủng B.
thuringiensis var kurstaki, được lưu hành và sử dụng ở Việt Nam. Bố trí thí nghiệm:
- Với Sâu ăn lá dưa chuột, Dưa hấu (Spodoptera litura Fabricius) được
chia vào các lô thí nghiệm bố trí trong các đĩa petri vô trùng với số lượng sâu như nhau (10 sâu/đĩa) và tương đối đồng đều về tuổi sâu. Thức ăn của sâu (lá dưa chuột tươi) sau khi lấy về được rửa sạch dưới vòi nước, để khô tự nhiên. Sử dụng panh vô trùng gắp lá dưa nhúng vào dịch lên men đã pha loãng tương ứng với từng chủng Bt. Gắp lá dưa ra, để ráo bớt dịch sau đó cho vào các đĩa petri. Trên thành đĩa petri ghi rõ chủng Bt, nồng độ pha loãng, ngày thí nghiệm... Thả sâu vào các lô thí nghiệm với số lượng 10 sâu/đĩa. Đậy các đĩa petri bằng vải màn thưa để đảm bảo môi trường trong đĩa luôn được thoáng khí. Đặt các đĩa thí
nghiệm trong phòng có nhiệt độ 250C.
Ở lô đối chứng, thức ăn của sâu được nhúng vào môi trường lên men vô trùng đã chuẩn bị sẵn (không có vi khuẩn Bt) và tiếp cho sâu ăn với lượng thức ăn và lượng sâu như tiến hành với các lô thí nghiệm có dịch Bt.
Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24h, 48h, 72h ở tất cả các lô thí nghiệm.
Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott:
(C - T) . 100 Trong đó:
A = A: % sâu chết
C C: Số sâu sống sót ở lô đối chứng.
T: Số sâu sống sót ở lô thí nghiệm.
- Với Sâu ăn lá Cải bắp và Su hào (Spodoptera exigua) thí nghiệm được bố
trí tương tự như đối với sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu.