1. Đơn vị đo hoạt độ:
Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thông tin quan trọng về lượng Enzyme trong đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng. Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được biểu diễn bằng đơn vị Enzyme. Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
Trong những điều kiện xác định ( bão hòa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng
Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm Enzyme.
Lớp 08DTP06 Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa bởi 1 phân tử Enzyme sau 1 phút.
Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút.
Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn.
Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng ta có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme. Có 3 nhóm phương pháp:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
- Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
* Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme có rất nhiều. Ở mỗi nước và mỗi phòng thí nghiệm có thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và thói quen. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo phương pháp thống nhất.
2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính được hoạt độ Enzyme
Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …)
3.Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase)
a/ Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme.
b/ Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH = 4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose.
4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao
a) Chủng giống vi sinh vật:
Muốn nhận chế phẩm Amylase có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều Amylase.
Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã có được điều kiện cần thiết để tạo ra chế phẩm Amylase có hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời gian và điều kiện nhất định nào đó. Loài người luôn tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới có hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen.
Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng
Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu.
b) Môi trường dinh dưỡng:
Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp Amylase.
Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit. Ngoài ra còn chứa muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin...
Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia...
Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau.
Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt độ cao từ Asp.awamori là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngô 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19% trấu. Hàm lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: to 32OC, độ ẩm 57% và nuôi trong 42 giờ.
Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose, fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự
Lớp 08DTP06 tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng nồng độ tới 0,15%; để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme. Ví dụ khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụ Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.
Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+ và photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu MgSO4, Amylase hầu như không đc tạo thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0,1 - 0,2%.
Canxi có trong thành phần của α-Amylase. Một phân tử α-Amylase có tới 2 hoặc 3 ion canxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi có trong phân tử; nhưng cũng có ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này còn phụ thuộc vào thành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic.
Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ Amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm –SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu tạo thành Enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo cho hoạt độ Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ Amylase của
Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml.
Hoạt độ của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt
Chủng Vi sinh vật Hoạt độ dv/g chất khô
Hoạt độ Amylase Hoạt độ D Hoạt độ Glu Hoạt độ Pr
Asp.oryae KC 70.0 450.0 30.0 50.0
Asp.oryae U476 85.0 665.0 80.0 40.0
Asp.niger S4-10-111 0.65 437.0 70.0 0.5
Asp.awamori 14.5 850.0 30.0 0
Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm:
• Nhiệt độ
Cần phải có trang bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. Bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào canh trường. Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Nhiệt độ không khí trước khi đưa vào phòng nuôi phải vào khoảng 22 – 250C, còn độ ẩm tương đối của không khí là 98 - 100%.
• Độ ẩm canh trường
Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triển nằm trong giới hạn 65 - 70%. Trong thực tế sản xuất, mức độ vô trùng không thể đạt được như trong phòng thí nghiệm nên người ta thường nuôi cấy trong canh trường có độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khống chế ở 50 - 60%. Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốc cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian. Do đó vấn đề cần đặt ra là phải bằng mọi biện pháp thực hiện tốt công việc vệ sinh. Muốn vậy trước hết phải tiệt trùng môi trường ở áp suất và thời gian thích hợp nhằm tiêu diệt các tế bào và bào tử vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu dùng làm môi trường.
Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm mốc thải ra một lượng nhiệt khá lớn nên canh trường bị nóng và làm giảm độ ẩm. Đổ nước lạnh xuống nền và phun nước quanh tường sẽ góp phần giảm nhiệt và giúp cho canh trường đỡ bị khô.
• pH môi trường
Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của môi trường vào khoảng 5,5 - 6,0. pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ Enzyme. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng: pH ban đầu thường vào khoảng 6 - 7. Đối với
Asp.orysee sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 - 6,0. Ngược lại khi nuôi Asp.awamori để nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 - 7,8.
Thực tế pH có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, vì thế trong sản xuất người ta sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu.
Lớp 08DTP06 Trong quá trình phát triển và tích tụ Enzyme, nấm mốc rất cần oxy. Trong sản xuất sinh học, sự phát triển của tế bào và tích tụ Enzyme có liên quan mật thiết tới sự có mặt của oxy.
Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt, nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của không khí qua sợi nấm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ Enzyme. Nếu môi trường dính bết, không khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra hô hấp yếm khí, ảnh hưởng xấu đến tích tụ Enzyme. Vì vậy ở mỗi giai đoạn của sự phát triển, tùy vào lượng oxy cần cho quá trình trao đổi chất và lượng nhiệt nấm mốc tỏa ra mà điều chỉnh lượng không khí vào phòng nuôi cho thích hợp.
Yêu cầu về lượng không khí và cung cấp oxy trong môi trường lỏng có những khác biệt. Yêu cầu đặt ra là phải làm sao để oxy của không khí hòa tan vào canh trường càng nhiều càng tốt. Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốc phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thông qua canh trường – khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy có thể hòa tan vào dung dịch. Lượng oxy hòa tan trong canh trường phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, áp suất, công nghệ sục khí cũng như hàm lượng và tính chất của các chất hòa tan trong dung dịch.