2. Probiotics
3.2.1. Hồn thiện cơng nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng
Chủng Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn sinh axit lactic, tế bào hình que, thuộc nhĩm vi khuẩn Gram +, khơng sinh bào tử; lên men sinh amylaza, proteaza, lên men đường lactoza, manoza, saccaroza và Glucoza, Catalase -…
3.2.1.1 Kết quả xác định đƣờng cong sinh trƣởng vi khuẩn L. acidophilus trong
hai mơi trƣờng MRS và dịch chiết dứa thích hợp.
Cả hai mơi trường tỷ lệ cấy giống ban đầu 5% và đạt mật độ tế bào khoảng 2.2 x 108 cfu/ml. Mơi trường MRS vốn là mơi trường đặc trưng cho vi khuẩn L. acidophilus nên phát triển rất nhanh. Sinh khối vi khuẩn tại giờ thứ 5 thì sinh khối vi khuẩn trong mơi trường MRS ( 1.6 x 108 cfu/ml) cao hơn so với mơi trường dịch chiết dứa thích hợp ( 0.4 x 108 cfu/l). Cả hai mơi trường pha lag đều trải qua khoảng 8 giờ, so với mơi trường MRS thì mơi trường dịch chiết dứa thích hợp vi khuẩn phát triển chậm hơn, do là mơi trường hồn tồn mới và khác hẳn so với mơi trường nhân giống của L. acidophilus. Sau 8 giờ thì vi khuẩn trong cả hai mơi trường điều chuyển sang pha log, đây là giai đoạn vi khuẩn phát triển với tốc tộ phát triển cực đại. Trong mơi trường MRS thì vi khuẩn đạt mật độ cực đại ( 6.8 x 108 cfu/ml) ở 16 giờ. Mơi trường dịch chiết dứa thích hợp vi khuẩn trãi qua pha log dài hơn, mất 18 giờ và đạt mật độ tế bào
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6.3 x108 cfu/ml. Kết quả trên cho thấy sự chênh lệch mật độ tế giữa hai mơi trường là khơng đáng kể, mơi trường dịch chiết dứa thích hợp cĩ thể thay thế cho mơi trường MRS trong lên men thu sinh khối vi khuẩn L. acidophilus. Theo nghiên cứu của Lê Hà Vân Thư, tác giả sử dụng mơi trường sữa gầy 12% khảo sát sự sinh trưởng của vi khuẩn L. acidphilus, kết quả mật độ tế bào đạt 1.2 x 108 cfu/ml [7]. Trong quá trình lên men tùy theo mục đích thu sản phẩm mà người ta chọn thời gian thu hồi sinh khối thich hợp. Chẳng hạn, để thu acid lactic thì người ta sẽ chọn cuối pha cân bằng vì trong suốt pha cân bằng vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh acid lactic, cịn đối với thu sinh khối vi khuẩn thường chọn thời gian mà vi khuẩn đạt tốc độ sinh trưởng cực đại ( thường trong pha log) . Do đĩ trong mơi trường dịch chiết nước dứa thích hợp thời gian thu sinh khối tốt nhất là tại thời điểm 18 giờ. Theo nghiên cứu của Dr Roslina Rashid, tác giả sử dụng mơi trường dịch nước dứa thải lên men thì mật độ tế bào đạt 7.3 x 106
cfu/ml. Trong thí nghiệm này tác giả chỉ sử dụng dịch nước dứa thải mà khơng bổ sung thêm nguồn nitơ nào [29]. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian (giờ) M ật đ ộ te á b ào ( x 1 0 8 cfu /m l) MRS Dứa
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn đường cơng sinh trưởng của vi khuẩn L. acidophilus nuơi trong hai mơi trường MRS và dịch chiết dứa
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.1.2 Kết quả xác định sự thay đổi pH theo thời gian của hai mơi trƣờng MRS và dịch chiết dứa . và dịch chiết dứa .
L. acidophilus là vi khuẩn lactic lên men đồng hình, do đĩ sản phẩm chính sinh ra là acid lactic làm pH mơi trường hạ thấp xuống, pH mơi trường thấp là một cớ chế ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên khi pH mơi trường thấp hơn 4 nĩ sẽ ức chế sự phát triển của chính bản thân nĩ. Kết quả trình bày hình 3.5.
0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 20 25 30
Thời gian (giờ)
pH
MRS Dứa
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian của hai mơi trường lên men MRS và dịch chiết dứa
pH cả hai mơi trường bắt đầu giảm nhanh từ giờ thứ 5 đến giờ thứ 16, giai đoạn này vi khuẩn đang ở pha log nên tổng hợp nhiều acid. Mơi trường MRS thì pH giảm xuống tới mức thấp nhất là 3.8 và khơng giảm nữa sau 16 giờ. Mơi trường dịch chiết dứa thích hợp pH giảm chậm hơn so với MRS, tại thời điểm 16 giờ pH chỉ 4, đến 18 giờ pH đạt giá trị thấp nhất 3.91 và khơng giảm sau 18 giờ. Do sự chênh lệch sinh khối của vi khuẩn trong cả hai mơi trường khơng nhiều nên sự khác biệt về giá trị pH của hai mơi khơng đáng kể. Từ kết quả trên cho thấy pH<4 cĩ thể ức chế sự phát triển của
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.1.3. Kết quả xác định hàm lƣợng đƣờng giảm theo thời gian của hai mơi trƣờng lên men MRS và dịch chiết dứa
Kết quả dựng đường chuẩn gluocse: y : OD x : Nồng độ đường (mg/ml) R : hệ số tương quan y = 1.957x + 0.0725 R2 = 0.9888 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Hàm lượng đường (mg/ml) OD
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường và OD
Mơi trường MRS và dịch chiết dứa thích hợp được lên men và lấy ra xác định hàm lượng đường tổng cịn lại trong mơi trường tại các thời điểm 5, 8, 16, 18, 20, 24 giờ. Ta dựa vào đường chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường. Kết quả trình bày ở hình 3.7.
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 25 30
Thời gian (giờ)
Hà m lư ợng đư ờng (m g/ m l) Dứa MRS
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường tổng thay đổi theo thời gian lên men của hai mơi trường MRS và dịch chiết dứa
Kết quả trên hình 3.7 cho thấy giai đoạn từ giờ thứ 5 đến giờ thứ 16 hàm lượng đường giảm rất nhanh do đây là giai đoạn pha log của vi khuẩn. Trong mơi trường MRS vi khuẩn sử dụng đường rất tốt, tại thời điểm 20 giờ thì hàm lượng đường rất thấp (0.97 mg/ml). Trong dịch chiết dứa thành phần đường chủ yếu là fructose và sucrose. Theo kết quả tơi phân tích hàm lượng đường tổng trong dịch dứa đạt 50 mg/ml, hàm lượng đường này cao hơn gấp đơi so với mơi trường MRS( 20 g glucose). Sinh khối vi khuẩn sau 18 giờ trong mơi trường dịch chiết dứa thích hợp khơng tăng nữa, pH là 3.91, lượng đường cịn lại với nồng độ 23.9mg/ml. Vi khuẩn chỉ sử dụng một nữa lượng đường trong mơi trường dịch chiết dứa. Mục đích của đề tài hướng đến việc tận dụng dịch nước dứa thải ra sau quá trình xử lý dứa ( tách vỏ và cùi) với hàm lượng đường trong dịch nước dứa thải 31.3 g/l. [29], đây là lượng đường đủ cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn tăng trưởng. Theo kết quả nghiên cứu Lim, C.H và cộng sự thì hàm lượng đường glucose thích hợp cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Lactobacillus salivarius i 24 là 33.2 g/l [31]. Theo nghiên cứu của Dr Roslina Rashid sử dụng nước dứa thải lên thu acid lactic bằng vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii kết quả hàm lượng đường được vi khuẩn sử dụng rất hiệu quả, lượng đường cịn lại sau 72 giờ là 0.16g/l
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
[29]. Do đĩ trong nghiên cứu này dịch chiết dứa thích hợp nên được pha lỗng ra để tránh lãng phí lượng đường cịn lại sau khi lên men.
3.2.1.4. Kết quả so sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuơi cấy L.
acidophilus trong mơi trƣờng MRS và dịch chiết dứa.
1. Kết quả xác định khả năng ức chế tổng quát của nuơi cấy:
E. coli ủ cùng với dịch li tâm của mơi trường MRS và dịch chiết dứa thích hợp sau lên men (khơng chỉnh pH), nhiệt độ 370C, hiếu khí và được đo OD sau 21 giờ. Kết quả trình bày hình 4.10. E. coli hầu như khơng phát triển. Sinh khối E. coli giảm 99.5% và 99.1% khi nuơi với dịch mơi trường MRS và dịch chiết dứa li tâm. Kết luận vi khuẩn L. acidophilus cĩ hoạt tính probiotics.
2. Kết quả xác định khả năng ức chế của bacteriocins.
Kết quả định lƣợng H2O2: Dịch lên men trong mơi trường MRS và dịch chiết dứa thích hợp được thu tại thời điểm 16 giờ và 18 giờ để xác định hàm lượng H2O2.
Kết quả: dịch lên men sau khi bổ sung các hĩa chất như trên, cuối cùng bổ sung
chỉ thị hồ tinh bột thì khơng thấy xuất hiện màu xanh đậm (kết hợp giữa hồ tinh bột và iode). Kết luận vi khuẩn L. acidophilus khơng sinh H2O2. L. acidophilus khơng sinh H- 2O2 trong điều kiện nuơi cấy tĩnh. Mẫu đối chứng thay dịch mơi trường sau lên men bằng nước cất bổ sung 3 giọt H2O2.
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8: Mơi trường dịch chiết dứa thích hợp khơng sinh H2O2
Kết quả định lƣợng acid: khơng định lượng được hàm lượng acid, do chỉ thị
màu khơng thể phân biệt được bước chuyển màu.
Kết quả xác định khả năng ức chế của bacteriocins :
L. acidophilus khơng sinh H2O2 trong quá trình lên men trong cả hai mơi trường MRS và dịch chiết dứa thích hợp, do đĩ yếu tố ức chế sinh trưởng cịn lại đối với E. Coli cĩ thể là acid hữu cơ và bacteriocins. Kết quả định lượng acid khơng thành cơng nên tơi xác định khả năng ức chế của bacteriocins bằng cách điều chỉnh pH dịch lên men về 6.0 để loại bỏ tác động của acid.
Dịch lên men cả hai mơi trường MRS và dịch chiết dứa sau khi lên men được chỉnh pH 6.0 bằng NaOH 1N, kết quả sinh khối E.coli giảm được biểu diễn trên hình 3.9: 99.5 27.5 99.1 13.3 0 20 40 60 80 100 120 khơng chỉnh pH chỉnh pH % ứ c ch ế tă ng t rư ở ng E .c o li MRS Dứa
Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E.coli) của dịch nuơi cấy L. acidophilus trên mơi trường MRS và dịch chiết dứa
Kết quả trên hình 3.9 cho thấy khi khơng chỉnh pH thì gần như 100% vi khuẩn
E.coli bị ức chế tăng trưởng khi ủ chúng với dịch nuơi cấy L. acidophillus trong cả MRS lẫn nước chiết dứa sau li tâm. Trái lại, khi loại bỏ tác động của acid hữu cơ bằng
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cách chỉnh pH về 6,0, E.coli ủ với dịch ly tâm L. acidophilus nuơi trong mơi trường MRS bị ức chế 27,5%; trong khi giá trị này chỉ là 13,3 % nếu nuơi cấy L. acidophilus
trong mơi trường dịch chiết dứa thích hợp. Điều đĩ cho thấy vi khuẩn L. acidophilus
tổng hợp bacteriocins trong cả hai mơi trường, nhưng trong mơi trường dịch chiết dứa thì lượng bacteriocin thấp hơn so với mơi trường MRS. Gần đây, người ta khám phá ra rằng chất cảm ứng Bacteriocin là một số peptide [30]. Cĩ thể rằng trong mơi trường MRS nguồn nitơ phong phú hơn (ngồi cao nấm men cịn cĩ peptone, cao thịt) cung cấp nhiều dạng peptide trong đĩ cĩ chất cảm ứng bacteriocins. Chất cảm ứng này cĩ lẽ khơng nhiều trong mơi trường dịch chiết dứa (chỉ chứa cao nấm men là nguồn nitơ hữu cơ duy nhất).
Như vậy, khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị E. coli của dịch nuơi cấy L. acidophilus li tâm chủ yếu là do tác động của acid hữu cơ.
2. Tính tốn kinh tế cho mơi trƣờng dịch chiết dứa
Giá thành sản phẩm tính cho 1 lít mơi trường dịch chiết dứa thích hợp:
Bảng 3.6: Tính tốn giá thành cho 1 lít mơi trường dịch chiết dứa thích hợp (2009)
Thành phần mơi trường Khối lượng Giá cả (VND)
Dứa 1 kg 17500 Triamonium hydrogen citrate 7 g 1190 K2HPO4 1.8g 180 Cao nấm men 20g 20000 Tween 80 1ml 160 Tổng cộng thành tiền: 39000
Trong 1 lít mơi trường MRS lượng sinh khối thu được là 6.8 x 1011
cfu, trong khi đĩ sinh khối thu được ở mơi trường dịch chiết dứa là 6.3. x 1011
cfu. Xét về mặt kinh tế một lít mơi trường MRS khoảng 314000 (VND) và mơi trưởng dịch chiết dứa thích hợp là 39000 (VND).Như vậy khi sử dụng mơi trường dịch chiết dứa thì chi phí giảm
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
88% so với giá thành khi sử dụng mơi trường MRS, lượng sinh khối thu được của hai mơi trường là tương đương nhau.
Để giảm giá thành và tận dụng lượng đường cịn lại sau khi thu sinh khối thì dịch chiết dứa cần được pha lỗng ½ để hàm lượng đường đạt 25 mg/ml, mơi trường chỉ cịn 30000 (VND)/l mơi trường. Giá thành giảm 90 % so với mơi trường MRS.
3.2.1.5. Nghiên cứu trạng thái nuơi cấy
Chủng giống được hoạt hố trên mơi trường MRS agar, nuơi trong tủ ấm 340C, sau 48 h khuẩn lạc mầu trắng sữa xuất hiện, trịn nhỏ và đều, bề mặt nhẵn bĩng. Chọn những khuẩn lạc mọc khỏe, cho vào ống nghiệm chứa 5ml mơi trường MRS, nuơi tĩnh ở 340
C, sau 24h tiếp tục nhân giống vào bình tam giác hoặc bình lên men chứa mơi trường MRS, với tỷ lệ nhân giống là 5%. pH = 6
L. acidophilus VN1 được nuơi dưới 2 điều kiện khác nhau: (i) nuơi tĩnh trong tủ ẩm trong các bình tam giác cĩ thể tích 1000 ml; và (ii) lên men trong hệ thống cĩ cánh khuấy với thể tích từ 20 lít trở lên. Tốc độ khuấy giới hạn ở mức 50 vịng/phút, thời gian lên men thích hợp 24 - 30 h, bổ sung chất phá bọt, pH mơi trường được điều chỉnh bằng NaOH. Sau 24 giờ và 48 giờ, xác định mật độ vi khuẩn (bảng 3.7).
Bảng 3.7: Xác định mật độ L.acidophilus VN1 dưới các trạng thái nuơi khác nhau
Điều kiện nuơi 24 h 48h
CFU/ml OD 620 CFU/ml OD 620 Tĩnh 1,2x109 0.45 – 0.52 2.,7x108 0.64 - 0,7 Khuấy 50 v/p 3,17x109 0.51 – 0.6 5.4x108 0.7 – 0.76
Trong điều kiện nuơi cấy cĩ khuấy nhẹ, sinh khối tạo thành cao hơn so với điều kiện nuơi tĩnh. Thời gian nuơi cấy 24 - 30 h cho lượng sinh khối cao nhất. Việc khuấy nhẹ sẽ giúp cho các pha mơi trường và pha vi sinh được trộn đều, như vậy các dưỡng chất được vi sinh vật sử dụng hết, và tránh được sự xuất hiện các khu vực cĩ pH và
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nồng độ các chất quá cao hay quá thấp, nhiệt độ khối dịch vì thế khơng làm ảnh hưởng tới quá trình lên men.
Sinh khối của L. acidophilus VN1 được thu hồi bằng phương pháp ly tâm, sau đĩ đơng khơ để bảo quản.
3.2.2. Hồn thiện cơng nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis B1 3.2.2.1. Xác định đƣờng cong sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis B1 trên 2 3.2.2.1. Xác định đƣờng cong sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis B1 trên 2
loại mơi trƣờng
Chủng Bacillus subtilis B1 sau khi hoạt hĩa được nuơi trong hai loại mơi trường MT1 và MT2. Sau các khoảng thời gian nhất định, xác định mật độ vi khuẩn bằng OD600. Đối chứng là ống mơi trường khơng cĩ vi khuẩn. Kết quả trên bảng 3.8.
Bảng 3.8 Mật độ chủng vi khuẩn nghiên cứu trong các loại mơi trường khác nhau theo thời gian
STT Thời gian
OD600nm
Mơi trường MT1 Mơi trường MT2
1 2h 0,200 0,355 2 4h 0,340 0,505 3 6h 0,460 0,615 4 8h 0,540 0,720 5 24h 0,620 0,820 6 26h 0,690 0,885 7 28h 0,725 0,940 8 30h 0,732 0,950 9 32h 0,732 0,950 10 48h 0,733 0,945 11 52h 0,735 0,945 12 54h 0,735 0,944
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 72h 0,73 0,942 14 76h 0,680 0,935 15 78h 0,540 0,820 16 80h 0,400 0,620 17 (Đ/c) 0,060 0,160
Kết quả nhận được cho thấy sau 28-32 giờ nuơi cấy, mật độ vi khuẩn ở trong cả hai loại mơi trường đều đạt cực đại, và ổn định đến 54 giờ, sau đĩ OD600 của vi khuẩn bắt đầu giảm. Trong mơi trường MT2, vi khuẩn tạo sinh khối cao hơn so với trong mơi trường MT1, điều này được thể hiện rất rõ qua giá trị OD600. Sau 30 giờ nuơi cấy, vi