2. Probiotics
3.2.1.5. Nghiên cứu trạng thái nuơi cấy
Chủng giống được hoạt hố trên mơi trường MRS agar, nuơi trong tủ ấm 340C, sau 48 h khuẩn lạc mầu trắng sữa xuất hiện, trịn nhỏ và đều, bề mặt nhẵn bĩng. Chọn những khuẩn lạc mọc khỏe, cho vào ống nghiệm chứa 5ml mơi trường MRS, nuơi tĩnh ở 340
C, sau 24h tiếp tục nhân giống vào bình tam giác hoặc bình lên men chứa mơi trường MRS, với tỷ lệ nhân giống là 5%. pH = 6
L. acidophilus VN1 được nuơi dưới 2 điều kiện khác nhau: (i) nuơi tĩnh trong tủ ẩm trong các bình tam giác cĩ thể tích 1000 ml; và (ii) lên men trong hệ thống cĩ cánh khuấy với thể tích từ 20 lít trở lên. Tốc độ khuấy giới hạn ở mức 50 vịng/phút, thời gian lên men thích hợp 24 - 30 h, bổ sung chất phá bọt, pH mơi trường được điều chỉnh bằng NaOH. Sau 24 giờ và 48 giờ, xác định mật độ vi khuẩn (bảng 3.7).
Bảng 3.7: Xác định mật độ L.acidophilus VN1 dưới các trạng thái nuơi khác nhau
Điều kiện nuơi 24 h 48h
CFU/ml OD 620 CFU/ml OD 620 Tĩnh 1,2x109 0.45 – 0.52 2.,7x108 0.64 - 0,7 Khuấy 50 v/p 3,17x109 0.51 – 0.6 5.4x108 0.7 – 0.76
Trong điều kiện nuơi cấy cĩ khuấy nhẹ, sinh khối tạo thành cao hơn so với điều kiện nuơi tĩnh. Thời gian nuơi cấy 24 - 30 h cho lượng sinh khối cao nhất. Việc khuấy nhẹ sẽ giúp cho các pha mơi trường và pha vi sinh được trộn đều, như vậy các dưỡng chất được vi sinh vật sử dụng hết, và tránh được sự xuất hiện các khu vực cĩ pH và
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nồng độ các chất quá cao hay quá thấp, nhiệt độ khối dịch vì thế khơng làm ảnh hưởng tới quá trình lên men.
Sinh khối của L. acidophilus VN1 được thu hồi bằng phương pháp ly tâm, sau đĩ đơng khơ để bảo quản.
3.2.2. Hồn thiện cơng nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis B1 3.2.2.1. Xác định đƣờng cong sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis B1 trên 2 3.2.2.1. Xác định đƣờng cong sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis B1 trên 2
loại mơi trƣờng
Chủng Bacillus subtilis B1 sau khi hoạt hĩa được nuơi trong hai loại mơi trường MT1 và MT2. Sau các khoảng thời gian nhất định, xác định mật độ vi khuẩn bằng OD600. Đối chứng là ống mơi trường khơng cĩ vi khuẩn. Kết quả trên bảng 3.8.
Bảng 3.8 Mật độ chủng vi khuẩn nghiên cứu trong các loại mơi trường khác nhau theo thời gian
STT Thời gian
OD600nm
Mơi trường MT1 Mơi trường MT2
1 2h 0,200 0,355 2 4h 0,340 0,505 3 6h 0,460 0,615 4 8h 0,540 0,720 5 24h 0,620 0,820 6 26h 0,690 0,885 7 28h 0,725 0,940 8 30h 0,732 0,950 9 32h 0,732 0,950 10 48h 0,733 0,945 11 52h 0,735 0,945 12 54h 0,735 0,944
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 72h 0,73 0,942 14 76h 0,680 0,935 15 78h 0,540 0,820 16 80h 0,400 0,620 17 (Đ/c) 0,060 0,160
Kết quả nhận được cho thấy sau 28-32 giờ nuơi cấy, mật độ vi khuẩn ở trong cả hai loại mơi trường đều đạt cực đại, và ổn định đến 54 giờ, sau đĩ OD600 của vi khuẩn bắt đầu giảm. Trong mơi trường MT2, vi khuẩn tạo sinh khối cao hơn so với trong mơi trường MT1, điều này được thể hiện rất rõ qua giá trị OD600. Sau 30 giờ nuơi cấy, vi khuẩn trong mơi trường MT2 cho giá trị OD600 lớn nhất là 0,95, gấp gần 1,3 lần so với khi nuơi ở mơi trường MT1 (OD600 lớn nhất chỉ đạt 0,735). Lượng sinh khối bắt đầu tăng nhanh sau khi nuơi 8h và đạt tới mức cân bằng sau khi nuơi 28h. Nhưng sau 76h nuơi cấy, thì vi khuẩn bắt đầu suy thối, sinh khối giảm đi rõ rệt.
Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu trong MT1 và MT2 được biểu thị trên hình 3.10 và 3.11
Đ/c 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48 52 54 72 76 78 80
Thời Gian
Hình 3.10. Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis B1 trong MT1
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11. Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng
Bacillus subtilis B1 trong MT2
Đồ thị 3.10 và 3.11 cho thấy, mơi trƣờng MT2 thích hợp hơn cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu, ngồi việc cho sinh khối lớn hơn, mơi trường này cịn kéo dài hơn trạng thái cân bằng so với khi sử dụng mơi trường MT1.
3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis B1:
1 Ảnh hƣởng của thời gian nuơi cấy
Vi khuẩn được nuơi trong mơi trường MT1 và MT2. Sau các khoảng thời gian 24h, 30h, 32h và 48h, xác định OD600
Bảng 3.9. Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu theo thời gian
Thời gian nuơi cấy OD600
Mơi trường MT1 Mơi trường MT2
24h 0,620 0,820 30h 0,732 0,950 32h 0,732 0,950 48h 0,732 0,945 Đ/c 2 4 6 8 24 26 28 30 32 48 52 54 72 76 78 80 Thời Gian
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2 Ảnh hƣởng của các nguồn Cacbon
Việc xác định ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau (2%) lên sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu được tiến hành trong mơi trường MT2 với cao nấm men như nguồn nitơ. Tế bào chủng Bacillus subtilis B1 đã hoạt hố qua đêm được nuơi trong 32h, ở 370C, lắc 200 vịng/phút. Kết quả trên bảng 3.10, hình 3.12
Bảng 3.10. Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu với các nguồn cacbon khác nhau
stt
Tên nguồn Cacbon OD600
1 Glucose (1) 0,78 2 Sucrose (2) 0,80 3 Glycerol (3) 0,30 4 Lactose (4) 0,32 5 Dextrin (5) 0,95 6 Soluble Starch (6) 0,85
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả cho thấy polysaccharides là nguồn cacbon tốt hơn so với monosaccharides và disaccharides cho chủng B. Subtilis B1. Sinh khối đạt cao nhất khi sử dụng dextrin làm nguồn cacbon (OD600= 0,95). Trong khi sinh khối đạt mức khá cao khi sử dụng glucose và sucrose như nguồn cacbon (OD600= 0,78 và 0,80, tương ứng.. Lactose và glycerol khơng thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
3 Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên sinh trưởng của chủng vi khuẩn B. subtilis B1 được tiến hành, sử dụng MT2 với dextrin làm nguồn cacbon. Vi khuẩn được nuơi ở điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp. Kết quả trên bảng 3.11 và hình 3.13 cho thấy cao nấm men là nguồn nitơ tốt nhất, với OD600 sau 24 giờ nuơi cấy là 0,95. Các nguồn nitơ vơ cơ như NaNO3, (NH4)2SO4 và urea khơng thích hợp cho sinh trưởng của chủng B. subtilis B1. Khi sử dụng (NH4)2SO4 và urea như nguồn nitơ, chủng B. subtilis B1 phát triển rất kém (OD600 chỉ đạt 0,34 và 0,37, tương ứng). Kết quả này trùng với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác cho rằng, dịch chiết nấm
Hình 3.12. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau tới sinh khối của B. subtilis B1
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
men là nguồn nitơ tốt nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn B. subtilis B1 và các nguồn nitơ vơ cơ khơng thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi khuẩn này. Bột đậu tương cũng là nguồn nitơ tốt cho chủng vi khuẩn này.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu
stt
Tên nguồn Nitơ OD600
1 Cao nấm men 0,950 2 NaNO3 0,300 3 (NH4)2SO4 0,340 4 Urea 0,370 1. 2.
4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuơi cấy : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuơi cấy đến quá trình sinh trưởng của Bacillus subtilis B1 đã được nghiên cứu, sử dụng mơi trường
Hình 3.13. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau tới tích luỹ sinh khối
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MT2 với nguồn cacbon là dextrin và cao nấm men làm nguồn nitơ. Vi khuẩn được nuơi dưới các điều kiện nhiệt độ 250
C, 300C, 370C, và 500C.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuơi cấy lên sinh trưởng của B. Subtilis B1
stt Nhiệt độ (oC) OD600
1 25 0,150
2 30 0,860
3 37 0,950
4 50 0,170
Kết quả nhận được trên bảng 3.12 cho thấy nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme là 370
C. Ở nhiệt độ này, chủng vi khuẩn nghiên cứu cĩ sinh khối cao nhất, cao gấp 6,3 lần so với khi nuơi ở nhiệt độ 250C và gấp gần 6 lần so với ở 500C. Nhiệt độ quá cao (500C) hoặc quá thấp (250C) đều khơng tốt cho sinh trưởng và sự tạo â-glucanase của chủng vi khuẩn này. Ở 300
C vi khuẩn cũng sinh trưởng khá tốt (OD600 = 0,86).
5 Ảnh hƣởng của pH
Nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu của mơi trường đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis B1 đã được tiến hành với mơi trường MT2, pH mơi trường trước khi nuơi cấy được điều chỉnh đến độ axit hoặc kiềm mong muốn. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.13
Bảng 3.13. Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu
dưới các điều kiện pH ban đầu khác nhau
Stt pH OD600
1 5,0 0.850
2 6,5-7,0 0.950
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Như vậy, qua bảng trên cĩ thể thấy rằng chủng vi khuẩn nghiên cứu phát triển tốt nhất ở pH trung tính. Sinh khối khi nuơi ở pH trung tính cao gấp gần 1,13 lần so với khi nuơi ở pH axit và pH bazơ.
B.subtilis B1 được nuơi trong mơi trường MPA bổ sung muối khống ở nhiệt độ 370
C với tỷ lệ nhân giống 5%, pH mơi trường 7,2.
Thời gian để thu hồi sinh khối tốt nhất là sau 24 – 28 h lên men.
B. subtilis B1 là chủng hiếu khí, vì vậy quá trình lên men được thực hiện ở chế độ lắc 200 RPM.
Bước 1: Hoạt hố B. subtilis B1 trên mơi trường NA ( cao thịt 3 g/L; peptone 10 g/L; agar 20 g/L., lấy khuẩn lạc trong đĩa thạch cho vào 5 ml mơi trường NB sau đĩ lắc 200 RPM ở 370c trong 24 h.
Bước 2: Nhân giống cấp 1 với tỷ lệ 10%, nuơi cấy ở điều kiện như trên.
Bước 3: Nhân cấp 2 cũng tiến hành tương tự trong điều kiện của quá trình nhân giống cấp 1.
Bước 4: Tiến hành lên men trong hệ thống cĩ cánh khuấy 200 rpm với dung tích lớn từ 50 lit trở lên, lưu ý với pH mơi trường sau 18 h lên men cần bổ sung thêm HCl 1N, với tỷ lệ 17 ml cho 10 lít dịch sinh khối để pH giữ ở trạng thái 7,2 – 7,6 là thích hợp cho quá trình lên men, sinh khối đạt được sau 24 h với pH thích hợp là 109 CFU.
Bảng 3.14: Đánh giá sự phát triển của B. subtilis B1 Time
(giờ)
pH OD
( = 550 nm)
Oxy hịa tan (%)
Quan sát dưới kính hiển vi
0 6,6 0,070 100 -
4 6,3 0,080 90 Bacilli đang phân chia
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12 7,5 0,360 85 Bacilli với nội bào tử:
khoảng 70% bào tử tự do
16 8,2 0,370 82 Bacilli với nội bào tử:
khoảng 80% bào tử tự do
20 8,3 0,330 70 Bacilli với nội bào tử :
khoảng 90% bào tử tự do
24 8,2 0,320 75 Bacilli với nội bào tử:
khoảng 98% bào tử tự do
Kết quả nhận được cho thấy chủng B. subtilis B1 phát triển tốt ở 370C, pH 7,2- 7,6 sau 24 giờ lên men thu sinh khối.
Kết quả thu đƣợc sau khi nghiên cứu các thơng số thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn VN 1 và B1
Sauk hi tiến hành nghiên cứu ở trên chúng tơi rút ra được kết quả tĩm tắt trong bảng 3.15 và bảng 3.16 như sau
Bảng 3.15: Điều kiện lên men thích hợp cho 2 chủng probiotics
Tên chủng pH t 0 (C) T (h) vịng quay (RPM) Mơi trường Mật độ VSV (CFU/ml) Bacillus subtilis B1 7,2 37 24 200 MPB 109 Lactobacillus acidophillus VN1 6,4 34 26 0 MRS 109
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.16: Thực hiện thu hồi và sản xuất nguyên liệu bột probiotic
Tên chủng Ly tâm RPM T0 (OC) Tỷ lệ trộn cơ chất (ml/g) pH Tỷ lệ muối cân bằng (%) Đơng khơ Bacilus subtillis B1 6000 40c 1/6 7 Na2S2O3: 2,4 Lactose: 2 T0 = -500c P = 10-4 tor (Christ 5 lit) Lactobacillus acidophillus VN1 6000 4 0 c 1/3 7
3.2.3. Hồn thiện cơng nghệ tách chiết thu hồi thành tế bào từ sinh khối
Saccharomyces cerevisie 1
Theo phương pháp tách và thu nhận thành tế bào thứ 1: từ 1000 g tế bào nấm men thu được 290 g thành tế bào (tương ứng với 33% trọng lượng tế bào).
Theo phương pháp thứ 2: từ 1000 g tế bào nấm men thu được 270 g thành tế bào (tương ứng với 27% trọng lượng tế bào).
Như vậy, trọng lượng khơ thành tế bào thu được ở phương pháp 1 nhiều hơn phương pháp 2 .
Theo phương pháp 2 cĩ thể xử lí thành tế bào nấm men bằng kiềm để hồ tan protein, lớp mannan, chitin của thành tế bào và các cấu tử khác. Kiềm phân huỷ các thành phần trong tế bào và tạo thành các cấu tử nhỏ hơn đi qua thành tế bào, và như vậy thành tế bào chỉ cịn chứa bêta-glucan khơng bị hồ tan trong kiềm. Việc xử lý bằng kiềm được tiến hành trong các điều kiện thích hợp cĩ thể thu được phần lớn cấu trúc ba chiều của thành tế bào khơng bị phá huỷ và tốt hơn nữa nếu bêta -glucan thành tế bào ở trạng thái nguyên vẹn và khơng bị biến đổi, như vậy các đặc tính sinh học của chúng sẽ khơng bị thay đổi.
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Do vậy phương pháp 2 đã được chọn để tách thành tế bào nấm men và sản phẩm thu được cĩ nhiều đặc tính thuận lợi hơn trong việc tách chiết bêta- glucan sau này sử dụng cho người vĩi chủng S. cerevisiae1.
Phương pháp 1 được chọn để tách thành tế bào từ men bia cơng nghiệp để sản xuất thực phẩm bổ sung cho chăn nuơi và nuơi trồng thủy sản
3.2.4. Hồn thiện cơng nghệ tách beta-glucan từ thành tế bào làm nguyên liệu cho chế phẩm bổ sung thức ăn
Sau khi loại bỏ lớp chitin, manoprotein, tiếp tục chiết lớp cặn thu được bằng NaOH 3%, khuấy đều, sau đĩ chỉnh pH đến 4,5 bằng HCl đặc. Khuấy dịch ở 750
C trong 2h. Để nguội, ly tâm 2000v/ph trong 10phút ở 40
C.
Rửa 2 lần bằng cồn tuyệt đối, trộn đều trong 10ph. Ly tâm mỗi lần 2000v/ph, 10ph ở 40C. Rửa tiếp 1 lần nữa bằng dietylete, trong 10-15ph, ly tâm 3000v/ph, thu cặn. Làm khơ cặn ở nhiệt độ phịng. Theo phương pháp đã miêu tả hàm lượng protein và hecxose trong sản phẩm -glucan được tách từ thành tế bào nấm men đã được xác định. Kết quả trên bảng 3.17.
Bảng 3.17:Hàm lượng protein và hexose trong sản phẩm glucan tách chiết từ thành tế bào của chủng nấm men nghiên cứu
Chủng Phương pháp tách OD (595nm) OD (488nm) %protein %hexose S.cerevisiae1 2 0.734 0.400 1 80
Men bia cơng nghiệp 1 0.734 0.400 2,4 75;7
Bảng 3.17 cho thấy sản phẩm -glucan từ mẫu 1 cĩ hàm lượng protein là 1% và hecxose 80%. Độ tinh sạch cao cĩ thể sử dụng trong thực phẩm chức năng cho người
Rất nhiều tác giả đã tách -Glucan từ Saccharomyces cerevisiae cho các mục đích khác như Jame at el (1991) đã tách -Glucan từ S. cerevisiae chủng hoang dại và
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chủng đột biến. Tác giả đã nhận được -Glucan cĩ hàm lượng protein <1% với tỷ lệ liên kết (1-3), (1,6) khác nhau và chế phẩm vẫn giữ được hình thái invivo.
Jung Nam Lee et al (2001) đã làm sạch -glucan tan với hoạt tính tăng miễn dịch từ thành tế bào S. cerevisiae. Thành tế bào sau khi được xử lý với 2% NaOH và làm sạch, glucan nhận được cịn chứa tới 2,8% protein của hỗn hợp mannoprotein. Sản phẩm đã được xử lý vơi axetic axit để giảm lượng protein xuống 0,8%.