- Mục đích: Thử nghiệm hoạt tính của enzyme với BC kết dính với cetite.
- Yêu cầu: Xác định hoạt tính riêng khi cố định enzyme với BC kết dính với cetite.
3.4.Tiến trình thí nghiệm
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát đặt tính sinh học của Acetobacter xylinum, quá trình nhân giống và quá trình lên men
3.4.1.1. Khảo sát đặt tính sinh học của Acetobacter xylinum BC
Cấy giống vi sinh vật vào môi trường đã chuẩn bị sẵn vào đĩa Petri,
thạch nghiêng, ống lỏng.
- Thạch đĩa: dùng que cấy vòng, cấy ria để phân tách từng khuẩn lạc. - Thạch nghiêng: dùng que cấy thẳng, cấy 1 đường thẳng, bắt đầu từ phần
thấp mặt nghiêng.
- Lỏng: cấy một vòng đầy que cấy vào lỏng, lắc que cấy để giống rơi vào ống môi trường.
Ủ các ống và đĩa ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ. Tiến hành nhuộm Gram (phụ lục 1) và quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Hình dạng tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi.
- Hình thái phát triển của vi sinh vật trên thạch nghiêng. - Đặc tính phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng.
- Hình thái khuẩn lạc phát triển trên môi trường đặt trong đĩa Petri.
3.4.1.2. Khảo sát quá trình nhân giống
Nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm chứa 10 ml dịch môi trường
Sau 5 ngày nuôi cấy, đổ 10 ml dịch giống cấp 1 vào 200 ml dung dịch môi trường tiến hành nhân giống cấp 2.
Chỉ tiêu theo dõi: mật độ tế bào xác định gián tiếp bằng phương pháptrãi đĩa đếm khuẩn lạc.
3.4.1.3. Khảo sát quá trình lên men tĩnh
Cho 200 ml dịch giống cấp 2 vào 1 lít môi trường, chiều cao lớp môi trường trong các khay khoảng từ 1 – 2 cm, để yên các khay lên men tĩnh, sau khi màng S-BC đạt độ dày bằng chiều cao lớp môi trường thì thu S-BC.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Sự thay đổi pH ở các khoảng thời gian xác định 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h. Đo bằng pH kế.
- Sự thay đổi nồng độ chất khô hòa tan ở các khoảng thời gian ở các khoảng thời gian xác định 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h. Đo nồng độ chất khô bằng Brix kế.
- Khối lượng BC thu được ở 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h. Thu BC ở các thời điểm và cân xác định khối lượng.
3.4.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm trong quá trình lên men BC kết dính vật liệu xơ dừa, mùn cưa
Cho giống cấp 2 vào 1lít môi trường nước dừa già (tỉ lệ 10% giống và 90% môi trường) và cho lần lược 50, 100, 150, 200 g phế liệu vào. Sau thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày lên men. Lấy sản phẩm đi ép tạo hình rồi sấy tới khối lượng không đổi, sau đó ép bằng máy ép thủy lực với lực ép cố định 167 kg/cm2
và kiểm tra chỉ tiêu cơ lý (gởi đến phòng thí nghiệm vật liệu Đại học Nông Lâm).
3.4.3. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm sử dụng S-BC làm tác nhân kết dính với vật liệu xơ dừa, mùn cưa
Tiến hành xử lý S-BC bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH 1.5% trong 1 giờ rồi ngâm tiếp trong nước 2 giờ, xay S-BC và phối trộn bột S-BC trương nở hoàn toàn với phế liệu đã được sấy đến khối lượng không đổi. Ép tạo hình rồi sấy tới khối lượng không đổi, sau đó ép bằng máy ép thủy lực với lực ép cố định 167 kg/cm2 và kiểm tra chỉ tiêu cơ lý. (qui trình 3.1)
Chỉ tiêu theo dõi: Chỉ tiêu cơ lý của sản phẩm kết dính ứng với từng tỉ lệ phối trộn bột BC (độ ẩm) với xơ dừa và mùn cưa: 20%, 25%, 30%, 45%, 40%. Bao gồm độ bền nén, độ bền kéo, vị trí cắt đứt tâm, góc uốn cong, tỷ lệ ngậm nước (gởi đến phòng thí nghiệm vật liệu trường Đại học Nông Lâm).
3.4.4. Thí nghiệm 4: Tạo màng BC kết hợp cetite cố định với enzyme
Sau khi lên men BC 1 ngày, đã tạo lớp BC có màng mỏng rồi cho celite vào. Một ngày sau lấy miếng BC đã kết dính với celite đem cố định với enzyme Termamyl, enzyme AMG, và hỗn hợp enzyme Termamyl với AMG.
Xác định hàm lượng protein ban đầu và hàm lượng protein cố định bằng phương pháp Brahford và xác định hoạt tính của enzyme ban đầu và enzyme cố định.
Hoạt tính của enzyme dựa vào khả năng thủy phân tạo sản phẩm đường khử của chế phẩm enzyme cố định.
Tiến hành tái sử dụng enzyme cố định và xác định các chỉ tiêu như: hàm lượng protein cố định (còn lại) và hiệu suất thủy phân của các chế phẩm enzyme cố định so với lần ban đầu cố định.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1.Kết quả khảo sát đặt tính sinh học của Acetobacter xylinum, quá trình
nhân giống và quá trình lên men
4.1.1. Kiểm tra vi thể
Thông qua nhuộm Gram (phụ lục 1) và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần chúng tôi nhận thấy vi khuẩn A. xylinum Gram âm, có dạng hình que, tế bào đứng riêng lẻ và có khả năng di động (hình 4.1).
Hình 4.1: Hình dạng vi khuẩn Gram âm Acetobacter xylinum
4.1.2. Kiểm tra đại thể
4.1.2.1. Đặc điểm sinh trưởng của A.xylinum trên môi trường đặc
Khuẩn lạc A. xylinum dạng tròn nhầy, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, rìa mép nhẵn, màu trắng đục và cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất. Sau 5 ngày nuôi cấy, kích thước trung bình của khuẩn lạc đạt từ 3-4 mm (hình 4.2).
Ở ngày cấy chuyền thứ 5 (120 phút), A.xylinum phát triển mạnh, tạo lớp màng dày mịn, phủ đều trên bề mặt thạch (hình 4.2) đó là sự kết dính giữa các tế bào với nhau nhờ sự chồng chập của các sợi BC được tổng hợp ở màng tế bào trong suốt trong quá trình phát triển. Phía đầu ống cấy chuyền, tế bào vi khuẩn ít nên không tạo thành màng dày mà chỉ tạo nhiều khuẩn lạc gắn liền nhau.
Hình 4.3: Ống cấy chuyền vi khuẩn A.xylinum
4.1.2.2. Đặc điểm sinh trưởng của A.xylinum trên môi trường lỏng
Thời gian đầu quá trình nhân giống (0-48h), dưới đáy môi trường có sự xuất hiện của nhiều sợi nhỏ lơ lửng, đó là những dải sợi do A.xylinum phun vào môi trường, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn lại với nhau tạo tấm cellulose trên bề mặt môi trường, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu Oxy.
Hình 4.4 và 4.5 là ống nghiệm nhân giống cấp 1 và erlen nhân giống cấp 2 ở ngày thứ 5 (120h) của quá trình nhân giống, bề mặt môi trường có lớp trắng dày là BC và trong môi trường lơ lửng nhiều sợi cellulose, theo thời gian các sợi này sẽ tạo lớp màng BC ngày càng dày trên bề mặt môi trường.
4.2.Kết quả khảo sát quá trình nhân giống
Mật độ tế bào ở từng thời điểm được thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1 Mật độ tế bào theo thời gian
Giờ Mật độ tế bào (tế bào/ml)
0 30.106 24 18.107 48 29.107 72 35.107 96 61.107 120 83.107 144 82.107 168 72.107 192 46.107
Hình 4.4: Ống nghiệm nhân giống cấp 1 vi khuẩn A.xylinum
Từ bảng 4.1 chúng tôi dựng đường cong sinh trưởng ở đồ thị 4.1, mật độ tế bào
A.xylinum tăng mạnh trong 24 giờ đầu của quá trình nuôi cấy, khi tế bào đang ở pha thích nghi, và bắt đầu tăng chậm từ 24 giờ đến 120 giờ khi ở pha sinh trưởng, mật độ tế bào đạt cực đại tại 120 giờ sau đó giữ ổn định ở pha cân bằng rồi giảm khi vào pha suy vong. Từ đường cong sinh trưởng chúng tôi sử dụng dịch nhân giống vào ngày thứ 5 (120 giờ) để tiến hành lên men.
4.3.Kết quả khảo sát quá trình lên men tĩnh BC kết dính với xơ dừa và mùn cƣa
Trong quá trình lên men chúng tôi đã khảo sát một số chỉ tiêu như pH, nồng độ chất khô hòa tan, khối lượng BC thô thể hiện ở bảng 4.2.
Từ bảng 4.2 ta có các đồ thị biểu diễn pH, nồng độ chất khô hòa tan, khối lượng BC thô theo thời gian.
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát các chỉ tiêu theo thời gian khi lên men tĩnh
Giờ pH Nồng độ chất khô hòa tan (độ Brix) Khối lượng BC (g/l)
0 4.1 8 0 24 4 7.8 104.7 48 3.98 7.6 178.7 72 3.65 7.5 366.5 96 3.14 7.3 617.1 120 3 7.2 689.4 144 3 7.1 730.9 168 3 7.1 774.2
Môi trường có mặt acid acetic nên pH dịch lên men ban đầu là 4.1, trong quá trình sinh trưởng và phát triển của A.xylinum, glucose bị đồng hóa thành acid gluconic và cellulose, do đó pH môi trường lên men liên tục giảm cho đến khi đi vào pha suy vong, lúc này pH = 3 không đổi cho đến khi kết thúc quá trình lên men (đồ thị 4.2).
Nồng độ chất khô hòa tan biểu thị lượng cơ chất trong môi trường đã được
A.xylinum sử dụng nên giảm dần theo thời gian từ (8 còn 7.1), khi nồng độ chất khô không đổi tức là A.xylinum đã không còn đồng hóa cơ chất, do đó chúng tôi kết thúc lên men vào ngày thứ 7 (168 giờ) (đồ thị 4.3).
Trong suốt quá trình lên men tĩnh, A.xylinum sinh cellulose liên tục, ứng với quá trình sinh trưởng và phát triển. Trong 24h đầu tiên của pha lag, khi tế bào vi khuẩn còn ở pha thích nghi, lượng S-BC tạo ra rất ít (ít hơn 104.7g). Từ 24h – 120h trong pha log, lượng S-BC tạo ra nhanh (từ 104.7g đến 689.4g) , sau đó chậm lại vào pha cân bằng và khi lượng S-BC đạt cực đại (774.2g) là khi vi khuẩn đã kết thúc quá trình lên men. Kết luận BC thu được cao nhất là vào ngày thứ 7 là 774.2g (đồ thị 4.4)
Đồ thị 4.3: Sự thay đổi nồng độ chất khô theo thời gian
Với mục tiêu thu nhận nhiều BC chuẩn bị cho khả năng khảo sát kết dính nên chúng tôi chú ý tới khả năng tạo BC nhiều của A. xylinum. Bên cạnh đó, chúng tôi nhận thấy glucose trong môi trường dinh dưỡng đóng vai trò như nguồn cung cấp năng lượng và tiền chất tạo cellulose, biến đổi thành acid gluconic nhờ enzyme dehydrogenase trên màng A. xylinum. Tính chất này không chỉ làm giảm sản lượng cellulose toàn bộ, mà còn làm giảm pH môi trường tới mức dưới điểm cực thuận của sự sống tế bào và tổng hợp cellulose. Chính vì điều này, nếu dùng nồng độ glucose ban đầu cao với mục đích nhận lượng cellulose cao thì không hiệu quả, bởi vì glucose quá mức sẽ chuyển thành acid gluconic nhiều và pH cũng giảm rất thấp. Tuy nhiên trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung acid acetic đóng vai trò cùng là cơ chất với glucose, acid acetic bị oxy hóa thành CO2 và nước, sinh ra ATP nhiều và tạo mức pH mong đợi. Mặc dù chính acid acetic không trực tiếp tạo cellulose. Và cơ chất của acetic đồng thời làm tăng pH, khắc phục sự giảm pH do tạo thành. Cùng với giống, môi trường dinh dưỡng cũng góp phần quan trọng vào khả năng tạo BC của vi khuẩn.
4.4.Kết quả khảo sát trong quá trình lên men BC kết dính với xơ dừa và mùn cƣa mùn cƣa
Sau khi cho giống cấp 2 vào môi trường lên men (tỉ lệ 10% giống và 90% môi trường lên men) cùng với xơ dừa (cho 2g xơ dừa vào khay khi quá trình lên men được 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày). Sau 7 ngày lên men hình 4.6 chúng tôi thấy trong quá trình lên men thì BC không kết dính được với xơ dừa, do trọng lực, BC được sinh ra tạo thành lớp nằm trên xơ dừa. A.xylinum có thể sử dụng nguồn carbon
là các monosaccharide, cụ thể là D-glucose có trong môi trường lên men để tạo cellulose ngoại bào. Vì vậy trong quá trình lên men A.xylinum chỉ có nhiệm vụ tạo BC chứ không có khả năng kết dính với xơ dừa.
4.5.Kết quả BC làm chất kết dính với xơ dừa và mùn cƣa (mạt cƣa)
Thực hiện theo mục 3.4.3
Hình 4.7: BC đã lên men 7 ngày
Hình 4.8: BC kết dính với vật liệu xơ dừa và mạt cƣa a) Sản phẩm vừa mới trộn
b) Sản phẩm sau khi sấy
Do quan sát thấy sinh khối tế bào vi khuẩn A. xylinum gắn kết với nhau thành màng, chúng tôi sử dụng tính kết dính của tế bào A. xylinum để làm các phần tử rời rạc của phế liệu (xơ dừa và mạt cưa) gắn với nhau mà không cần keo hóa học. Các khảo sát ban đầu, trộn BC với các phế liệu (xơ dừa và mạt cưa) tỷ lệ 15%, 20%, 25%, 30%, 35% cho thấy khả năng kết dính của BC với các phế liệu và sau đó đem ép chặt và sấy khô, tiếp theo đem so sánh với ván ép Frama. Nghiên cứu này nhằm làm tiền đề cho hướng phát triển sử dụng sinh khối A. xylinum làm tác nhân kết dính, để tạo một số vật liệu có giá trị từ phế thải nông nghiệp.
Sau khi ép mẫu với lực ép cố định 167 kg/cm2, chúng tôi tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ lý sản phẩm như: độ bền nén, độ bền kéo, vị trí đứt cách tâm, góc uốn cong và tỷ lệ ngậm nước. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng ván ép hiệu FRAMA để làm đối chứng so sánh. Kết quả đánh giá độ chịu lực của sản phẩm như sau:
4.5.1. Kết quả đối với độ bền nén
Bảng 4.3: Độ bền nén của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cƣa
Độ bền nén (kg/cm2 ) Tỷ lệ bột BC/vật liệu 15% 20% 25% 30% 35% Xơ dừa 448 546.67 638.33 706.67 726.67 Mạt cƣa Không có kết dính 370 525 675 718.33 FRAMA 700
Hình 4.9: Sản phẩm BC kết dính với xơ dừa sau khi ép
15% 20% 25% 30% 35% % kg/cm
Đồ thị 4.5: So sánh độ bền nén của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cƣa
Từ đồ thị 4.5 chúng tôi thấy độ bền nén của sản phẩm kết dính với xơ dừa (từ 448 đến 726.67 kg/cm2) và độ bền nén của sản phẩm kết dính với mạt cưa (từ 370 đến 718.33 kg/cm2) tăng theo tỷ lệ phối trộn (15% đến 35%), tỷ lệ bột BC càng cao thì độ bền nén càng cao. Độ bền nén của sản phẩm kết dính với xơ dừa (726.67 kg/cm2 ở tỷ lệ 35%) cao hơn độ bền nén của sản phẩm kết dính mạt cưa (718.33 kg/cm2 ở tỷ lệ 35%). Riêng ở tỷ lệ 15%, sản phẩm kết dính với xơ dừa có độ bền nén là 448 kg/cm2
còn sản phẩm kết dính với mạt cưa không xác định được độ bền kéo nghĩa là sp không có khả năng kết dính.
Đồ thị 4.6: So sánh độ bền nén của các sản phẩm kết dính tỷ lệ BC/ vật liệu 25% và ván ép FRAMA
Xơ dừa Mạt cưa FRAMA
Từ các đồ thị 4.6, 4.7, 4.8 chúng tôi thấy độ bền nén của các sản phẩm tương đương với sản phẩm tương tự là ván ép FRAMA (700 kg/cm2). Đối với đồ thị 4.7 cả hai sản phẩm (tỷ lệ 25%) có độ bền nén thấp hơn ván ép FRAMA. Đồ thị 4.8 sp kết dính (tỷ lệ 30%) với xơ dừa (706.67 kg/cm2) cao hơn một chút, còn sp kết dính với mạt cưa (675 kg/cm2) vẫn còn thấp hơn ván ép FRAMA. Đồ thị 4.9 cho thấy cả hai sp (tỷ lệ 35%) đều cao hơn ván ép FRAMA. (726.67 kg/cm2 và 718.33 kg/cm2).
Đồ thị 4.8: So sánh độ bền nén của các sản phẩm kết dính tỷ lệ BC/ vật liệu 35% và ván ép FRAMA
Xơ dừa Mạt cưa FRAMA
kg/cm2
Đồ thị 4.7: So sánh độ bền nén của các sản phẩm kết dính tỷ lệ BC/ vật liệu 30% và ván ép FRAMA
4.5.2. Kết quả đối với độ bền kéo
Bảng 4.4: Độ bền kéo của sản phẩm kết dính xơ dừa và mạt cƣa
Độ bền kéo (kg/cm2 ) Tỷ lệ bột BC/vật liệu 15% 20% 25% 30% 35% Xơ dừa 2.033 2.233 2.567 2.783 2.833 Mạt cƣa Không có kết dính 2.083 2.283 2.483 2.733 FRAMA 2.5
Độ bền kéo được định nghĩa là tỉ số giữa lực trên một đơn vị diện tích mặt cắt bị kéo căng. Tính chất này thể hiện độ bền của BC.
Từ đồ thị 4.9 chúng tôi thấy độ bền kéo của sản phẩm kết dính với xơ dừa (từ 2.033 đến 2.833 kg/cm2) và độ bền kéo của sp kết dính với mạt cưa (từ 2.083 đến 2.733 kg/cm2) tăng theo tỷ lệ phối trộn, tỷ lệ bột BC càng cao thì độ bền kéo càng cao. Độ bền kéo của sp kết dính với xơ dừa (2.833kg/cm2 ở tỷ lệ 35%)