Hàm lượng protein trong chế phẩm enzyme tự do và chế phẩm enzyme cố định được xác định theo phương pháp Bradford. (phụ lục 4)
Kết quả đường chuẩn:
Bảng 4.8: Mối tƣơng quan giữa ∆OD và nồng độ protein chuẩn
Nồng độ protein (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 2
∆OD 0.06 0.07 0.083 0.094 0.107 0.175
Theo đồ thị chúng tôi có phương trình đường chuẩn là: y = 0.0645x + 0.0444 (đem pha loãng 100 lần).
Từ đồ thị 4.21 chúng tôi xác định hàm lượng protein của chế phẩm enzyme ban đầu và enzyme cố định.
Bảng 4.9: Kết quả hiệu suất cố định protein
Các enzyme Termamyl AMG Termamyl với AMG
Tổng hàm lượng protein ban đầu (mg) 154.93 5.06 47.96
Tổng hàm lượng protein cố định (mg) 140.57 4.65 42.38
Hiệu suất cố định protein (%) 90.73 91.84 88.36
Nhận xét: Từ đồ thị 4.22 chúng tôi thấy màng BC kết hợp celite cho hiệu suất hàm lượng cố định protein của enzyme Termamyl là 90.73%, enzyme AMG là 91.84% cao nhất và hỗn hợp của hai enzyme đó là 88.36%.
4.6.2. Kết quả hiệu thủy phân của các chế phẩm enzyme cố định
Để đánh giá khả năng hoạt độ của chế phẩm enzyme cố định (hoạt tính), chúng tôi dựa vào sản phẩm tạo thành là đường khử.
Hiệu suất thủy phân các chế phẩm enzyme tự do và chế phẩm enzyme cố định được xác định theo phương pháp đường khử DNS (phụ lục 3).
Kết quả đường chuẩn glucose:
Termamyl AMG Termamyl và AMG
%
Đồ thị 4.22: Hiệu suất cố định protein
Bảng 4.10: Tƣơng quan giữa ∆OD và nồng độ glucose chuẩn
Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
∆OD 0 0.177 0.312 0.463 0.611 0.743
Theo đồ thị 4.23 có phương trình đường chuẩn: y = 1.4766x + 0.0152
Từ đồ thị 4.23 chúng tôi xác định được tổng hàm lượng đường khử tạo thành bởi enzyme tự do, enzyme cố định và hiệu suất thủy phân.
Bảng 4.11: Hiệu suất thủy phân tạo đƣờng khử của các chế phẩm enzyme cố định
Các enzyme Termamyl AMG Termamyl với AMG
Tổng HL đường khử enzyme ban đầu (mg/ml) 50.28 361.6 256.16
Tổng HL đường khử enzyme cố định (mg/ml) 46.96 274.54 214.62
Hiệu suất thủy phân (%) 93.39 75.92 83.79
Xác định hiệu suất thủy phân theo công thức 2, mục 3.2.3 và xem thêm chi tiết phụ lục 7.
Nhận xét: Enzyme cố định được sử dụng trong công nghệ thực phẩm và cả phân tích. Chúng cung cấp nhiều lợi ích hơn hẳn enzyme tự do như: khả năng tách riêng biệt giữa chất phản ứng và sản phẩm, khả năng tái sử dụng… Từ đồ thị 4.24 chúng tôi thấy màng BC kết hợp celite cho hiệu suất thủy phân tạo đường khử của enzyme Termamyl là 93.39% cao nhất, enzyme AMG là 75.92% và hỗn hợp của hai enzyme đó là 83.79%.
4.6.3. Kết quả khảo sát sự rửa trôi protein của các chế phẩm enzyme cố định
Một trong những ưu điểm của enzyme cố định là tái sử dụng, nhờ vậy mà giảm rất nhiều chi phí tốn kém. Đây là kết quả tái sử dụng của enzyme cố định.
%
Đồ thị 4.24: Hiệu suất thủy phân tạo đƣờng khử của các chế phẩm enzyme cố định
Termamyl AMG Termamyl và AMG
Hình 4.12. : Dung dịch protein nhuộm Bradford bị rửa trôi qua các lần tái sử dụng
Bảng 4.12: Số liệu xác định phần trăm proteincđ qua các lần tái sử dụng
Enzyme
Termamyl AMG Termamyl va AMG
Hlprotein(mg) proteincđ (%) Hlprotein(mg) proteincđ (%) Hlprotein(mg) proteincđ (%)
Lần 1 132.29 94.11 3.47 74.71 40.15 94.74 Lần 2 103.13 73.36 2.3 49.51 23.05 73.36 Lần 3 77.34 55.02 1.7 36.63 5.56 55.02 Lần 4 31.77 22.6 0.95 20.39 1.95 22,6 Lần 5 15.10 10.74 0.32 6.94 1.04 10.74 Lần 6 2.86 2.03 0.02 0.45 0.34 2.03
Nhận xét: Tiến hành tái sử dụng enzyme cố định ở nhiệt độ 500C để xác định hàm lượng protein sau những lần tái sử dụng. Để xác định phần trăm protein cố định qua các lần tái sử dụngchúng tôi sử dụng công thức 3 ở mục 3.4.3. Từ đồ thị 4.25 chúng tôi thấy phần trăm protein cố định giảm đáng kể qua các lần tái sử dụng. Như Termamyl tái sử dụng lần 1 có tỉ lệ là 94.11% giảm mạnh còn 2.03%. Số liệu chi tiết ở phụ lục 7
AMG cũng vậy tái sử dụng lần 1 có tỉ lệ là 74.71% giảm mạnh còn 0.45%. Cũng vậy hỗn hợp hai enzyme tái sử dụng lần 1 có tỉ lệ là 94.74% giảm mạnh còn 2.03%. Như vậy có nghĩa là do liên kết hấp phụ enzyme không bền dẫn đến sự rửa trôi protein thất thoát nhiều qua các lần tái sử dụng.
4.6.4. Kết quả hiệu suất tái sử dụng của các chế phẩm enzyme cố định
Bảng 4.13: Hiệu suất thủy phân tạo đƣờng khử của các enzyme cố định qua các lần tái sử dụng
Enzyme
Termamyl AMG Termamyl va AMG
HLglucose (mg) Tỉ lệ (%) HLglucose (mg) Tỉ lệ (%) HLglucose (mg) Tỉ lệ (%)
Lần 1 41.63 88.64 98.66 35.94 73.68 34.33 Lần 2 29.94 63.75 90.90 33.11 60.67 28.27 Lần 3 27.08 57.67 76.02 27.69 54.51 25.39 Lần 4 16.19 34.48 75.83 27.62 44.72 20.83 Lần 5 7.89 16.82 70.79 25.79 34.50 16.08 Lần 6 1.49 3.19 60.70 22.11 29.30 13.65 Lần 7 0.89 1.89 52.71 19.19 23.37 10.89 Lần 8 0.19 0.4 48.02 17.49 15.75 7.34
Số liệu chi tiết xem phụ lục 7
Nhận xét: Đây là kết quả hiệu suất tái sử dụng của enzyme cố định xác định hàm lượng glucose tạo thành. Từ đồ thị 4.26 chúng tôi thấy hiệu suất thủy phân tạo glucose của các enzyme cố định giảm đều. Cũng như kết quả mục 4.6.3 do có sự rửa trôi protein enzyme. Kết quả cho thấy việc áp dụng phương pháp hấp phụ enzyme với vật liệu hữu cơ là BC và vô cơ là celite là không hiệu quả. Để mở rộng nghiên cứu chúng ta có thể sử dụng màng BC – celite cố định enzyme theo phương pháp liên kết thông qua một số chất hoạt hóa làm tay gắn với enzyme đề tạo liên kết bền hơn.
Đồ thị 4.26: Khảo sát khả năng tái sử dụng của các enzyme cố định
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
5.1.1. Khảo sát quá trình nhân giống
- Thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại là 120h (5 ngày). - Thời gian kết thúc quá trình nuôi cấy là 168h (7 ngày).
5.1.2. Khảo sát khả năng kết dính
- BC hoàn toàn có thể sử dụng làm tác nhân kết dính.
- Tỷ lệ phối trộn BC càng cao, các chỉ tiêu cơ lý càng cao. Tốt nhất là trộn ở tỉ lệ ở 35%.
- Khả năng BC kết dính với xơ dừa cao hơn BC kết dính mạt cưa.
5.1.3. Tạo màng BC kết hợp celite cố định enzyme
- Hiệu suất protein cố định và hiệu suất thủy phân glucose tương đối cao. Termamyl (90.73%, 93.39%), AMG (91.84%, 75.92%), hỗn hợp enzyme Termamyl với AMG (88.36%, 87.79%).
- Số lần tái sử dụng các enzyme cố định để xác định hiệu suất protein và thủy phân glucose không cao.
5.2. Đề nghị
Do thời gian và điều kiện có giới hạn nên đề tài còn nhiều hạn chế. Chúng tôi xin đề nghị một số ý kiến sau:
- Thử nghiệm khả năng kết dính của BC tạo sản phẩm ván ép từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như: bã trấu, bã mía, rơm, …
- Tiến hành khảo sát khả năng kết dính của A-BC (lên men chìm tạo BC) để kết dính với các phế liệu nêu trên.
- Tiến hành khảo sát khả năng kết dính của BC tạo ra từ nhiều giống
- Tiến hành khảo sát khả năng kết dính của BC tạo ra từ nhiều nguồn nguyên liệu khác như môi trường rỉ đường, nước mía, nước ép dứa, … - Khảo sát thêm việc tạo màng BC kết hợp với vật liệu vô cơ khác như
silicagel, TiO2 …
- Mở rộng áp dụng phương pháp liên kết enzyme đối với màng BC kết hợp với cetite.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nƣớc
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1975), “Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2”, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr.205.
2. Phạm Thành Hổ (2007), “Hoàn thiện quy trình sản xuất cellulose vi khuẩn ở qui mô pilot và bước đầu ứng dụng trong thực phẩm, y dược và vật liệu mới”, Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học trọng điểm ĐHQGHCM, 2007.
3. Phạm Thành Hổ (2006), “Sử dụng sinh khối Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính để tạo một số vật liệu có giá trị từ phế thải nông lâm nghiệp”, Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học R, tháng 11/2006, trang 3 – 22.
4. Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ (2004). “Sử dụng cellulose vi khuẩn trong bảo quản dừa”, HNKH trường Đại học KHTN 2004.
5. Nguyễn Thúy Hương (2006) , “Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, ĐHQG TpHCM.
6. Nguyễn Thúy Hương (2006), “ Hoàn thiện quy trình sản xuất Cellulose, ứng dụng làm chất kết dính các sản phẩm phế liệu”, 2006.
7. Nguyễn Thúy Hương (1998) “Chọn dòng Acetobacter xylinum phát triển nhanh và một số biện pháp cải thiện sản xuất cellulose vi khuẩn”, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, tháng 12/1998.
8. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền, Tạ Thu Hằng (2004), “Công nghệ enzyme”, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004. 9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), “Thí nghiệm
công nghệ sinh học tập 2 thí nghiệm vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh, 2003.
10.Nguyễn Đức Lượng (2001), “Công nghệ sinh học”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2001.
11.Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ vi sinh vật”, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM, 1998.
12.Đinh Thị Kim Nhung (2000), “Một số kết quả nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn
Acetobacter xylinum ứng dụng vào làm thạch dừa”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 38, số 1, trang 28 – 34.
Tài liệu nƣớc ngoài
13.A.Krystynowicz, W. Czaja, A. Wiktorowska – Jezierska, M. Goncalves – Miskiewicz, M. Turkiewicz and S. Bielecki (2002) Factors affecting theyield and properties of bacterial cellulose. Journal of industrial Microbiology & Biotechnology 29.
14.Bielecki, S., Krystynowicz, A., Tukiewicz, M., Kalinowska, H., “Bacterial Cellulose” Technical University of Lódz, Stefanowskiega, Poland, p. 37-46.
15.Brown, R.M. (1999) Cellulose structure and biosynthesis. Pure Appl. Chem., Vol. 71, No. 5, p. 765-775.
16.Cheetham P.S.J et al. (1979) Studies on cell immobilization using Calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng, p. 1740-2168.
17.Dudman, W.F. (1959b) Cellulose Production by Acetobacter acetigenum and other
Acetobacter spp.. Journal of General Microbiology, 21, p. 812-826.
18.Duangjai Ochaikul*, Karuna Chotirittikrai, Jiraporn Chantra and Sinith Wutigornsombatkul (2006) Studies on fermentation of monascus purpureus
TISTR 3090 with bacterial cellulose from Acetobacter xylinum TISTR 967, KMITL. Sci. Tech. J. Vol. 6 No. 1 Jan. – Jun, 2006.
19.Hestrin, S., Ascher, M., and Mager, J. (1947) Synthesis of cellulose by resting cell of Acetobacter xylinum. Nature, Vol. 159, p. 64 – 65.
20.Hirai, A., Horii, F. (1999) Cellulose assemblies produced by Acetobacter xylinum. ICR Annual Report, Vol.6, p. 28-30.
21.Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T. (1994)Bergey’s Manual® of determinative bacteriology. Williams & Wilkins,
p.71,126.
22.Kunihiko Watanabe, Mari Tabuchi, Yasushi Morinaga and Fumihiro Yoshinaga (1998) Structural features and properties of bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose (1998) Vol. 5, p. 187-200.
23.Prof. Dr. Eng. Stanislaw Bielecki, Dr. Eng. Alina Krystynowicz, Prof. Dr.Mariana Turkiewicz, Dr. Eng. Halina Kalinowska, “Bacterial cellulose”. Institute of Technical Biochemistry, Technical University of Lódz,Stefanowskiego 4/10, 90 - 424 Lóbz, p. 37 – 46.
24.S. Hestrin and M. Schramm (1954) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum. Laboratory of Microbiologycal chemistry, Department of Biochemistry, Hebrew University Hadassah Medical school, Jerusalem, Israel, received 20 April, 1954.
25.Schramm, M., and Hestrin, S., (1954) Factors Affecting production of Cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. Joural of General Microbiology, 11, p. 123-129.
26.Son, H.J., Heo, M.S., Kim, Y.G., Lee, S.J. (2001) Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated
Acetobacter sp. A9 in shaking cultures. Biotechnol. Appl. Biochem. 33, p. 1-5. 27.Tahara N., Tabuchi M., Watanabe K., Morinaga Y., Yoshinaga F. (1997) Degree
of polymerization of cellulose from Acetobacter xylinum BPR 2001 dereased by cellulose produced by the strain. Bioscience Biochnology & Biochemistry, Vol. 61, No.11, p. 1862-1865, 11/1997.
28.Watanebe K, Yamanaka S. (1995) Effects of oxygen tension in the gaseous phase on production and physical properties of bacterial cellulose formed under statis culture conditions. Biosci Biotechnol Biochem 59, p. 65-68.
29.Y. Chao, Y. Sugano, M. Shoda (2001), “Bacterial cellulose production under oxygen-enriched air at different fructose concentrations in a 50-liter, internal-loop airlift reactor”, Appl Microbial Biotechnol, Vol 55, p. 673-679.
Tài liệu từ intermet. 30. http://bisoco.thuonghieuviet.com/wood.html 31. http://www.w3c.org/TR/1999/REC-html1401-19991224/loose.dtd 32. http://ecystage.ecy.wa.gov/programs/ari/pdfs/plywood3.pdf 33. http://www.bacterio.cict.fr/a/acetobacter.html 34. http://sres-associated.anu.edu.au/fpt/plywood/intro.html 35. http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/position1.html 36. http://vietsciences.free.fr/ 37. http://www.sinhhocvietnam.com 38. http://vi.wikipedia.org/wiki 39. http://tvtl.bachkim.vn 40. http://www.ebook.edu.vn 41. http://www.docjax.com
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phƣơng pháp nhuộm Gram
Phương pháp này do Christim Gram đưa vào năm 1884, ngày nay nó được thông dụng trong vi sinh vật học. Đây là phương pháp nhuộm quan trọng dùng để định loại vi sinh vật dựa trên thành phần cấu tạo của chúng. Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của một số loài vi sinh vật có chứa phức chức protein đặc biệt mà trong thành phần của nó có muối ribonudecleat Mg, khi nhuộm phức chất này kết hợp với loại thuốc nhuộm triphenyl metan (như gentian violet, cristal violet, methyl violet …) và iod sẽ cho màu tím rất bền vững chịu được tác dụng của cồn. Những vi khuẩn có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương, nếu không gọi là vi sinh vật Gram âm [9], [41].
Cách nhuộm:
Phụ lục 2: Định lƣợng gián tiếp vi sinh vật bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc: của phương pháp này là gieo cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường đặc trong hộp petri sau đó đếm số khuẩn lạc mọc rồi suy ra kết quả.
Cách tiến hành:
Pha loãng vật phẩm nghiên cứu: chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô khuẩn, một số pipet 1ml vô khuẩn. Hút 1ml vật phẩm nghiên cứu cho vào ống nghiệm thứ 1, lắc đều, sau đó lấy 1ml dịch ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2, lắc đều và tiếp tục làm như vậy từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3 … cứ mỗi lần pha loãng như vậy ta có tỉ lệ pha loãng 1/10. Tùy lượng vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên cứu (ước đoán) mà mức độ pha loãng nhiều hay ít: 1/1, 1/10, 1/100, 1/1000 …
Gieo cấy trên môi trường trong hộp petri: Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng cho vào đĩa petri, đổ thạch vào đĩa petri, xoay thạch trộn đều với dịch, đồng thời giàn đều trên đáy đĩa. Hé mở nắp đĩa cho hơi nước bốc ra và thạch đặc lại, sau đó xoay ngược hộp cho đáy lên trên và để vào tủ ẩm có nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật phát triển [9], [41].
Đếm số khuẩn lạc phát triển, bỏ những đĩa có số khuẩn lạc vi khuẩn quá ít (dưới 10) hoặc quá nhiều (trên 300). Số lượng tế bào trong 1ml mẫu (mật độ tế bào) được tính bằng công thức:
Trong đó:
n: số khuẩn lạc tế bào trong 1 đĩa petri ở độ pha loãng nhất định. V: thể tích dịch mẫu đem cấy.
D: hệ số pha loãng.
Mật độ tế bào = D
V n
Phụ lục 3: Phƣơng pháp DNS
Hàm lượng glucose xác định bằng cách đo mật độ quang của dung dịch sau thủy phân với sự có mặt của thuốc thử DNS.
Bảng 1: Các bƣớc tiến hành xác định hoạt độ enzyme của dung dịch mẫu.
Ống nghiệm số 0 1 2 3 Hồ tinh bột 0.5%(ml) 2 2 2 2 Đệm acetat pH=5(ml) 1 1 1 1 Dung dịch enzyme (ml) 0 2 2 2 Để hỗn hợp phản ứng ở 500 C, thời gian 10 phút. Dung dịch enzyme (ml) 2 0 0 0
Đun sôi 10 phút để dừng phản ứng, sau đó hút ra 1ml cho vào các ống nghiệm sạch khác.
Dung dịch thủy phân (ml) 1 1 1 1
Thuốc thử DNS (ml) 3 3 3 3
Đun sôi cách thủy trong 10 phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 540nm