Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………. 21
2.2.2. Thử nghiệm nồng độ của chế phẩm Thymol và bạc hà có hiệu quả hạn chế vi khuẩn R.solanacearum trong invitro. hạn chế vi khuẩn R.solanacearum trong invitro.
+ Nghiên cứu các hợp chất để hoà tan tinh dầu Thymol, Bạc Hà.
+ Thử nghiệm khả năng hạn chế bệnh HXVK (nồng độ, thời gian và phương pháp xử lý). phương pháp xử lý).
+ Kiểm tra hoạt tính của chế phẩm đối với bệnh HXVK. Thời gian và phương pháp bảo quản. phương pháp bảo quản.
2.2.3. Thử nghiệm hiệu quả các biện pháp phòng trừ tổng hợp đối với bệnh HXVK trên cây cà chua ở nhà lưới và ngoài đồng (diện hẹp 500m2) bệnh HXVK trên cây cà chua ở nhà lưới và ngoài đồng (diện hẹp 500m2)
Tiến hành thử nghiệm các biện pháp phòng trừ tổng hợp có sử dụng chế phẩm (Thymol và tinh dầu bạc hà) đối với bệnh HXVK ở nhà lưới và diện phẩm (Thymol và tinh dầu bạc hà) đối với bệnh HXVK ở nhà lưới và diện hẹp ngoài đồng tại Hà Nội và Bắc Ninh.
2.2.3.1.Thử nghiệm các biện pháp phòng trừ tổng hợp trong nhà lưới
Thử nghiệm các biện pháp phòng trừ: xử lý hạt giống với chế phẩm sinh học, xử lý bệnh với Thymol và tinh dầu bạc hà, chọn lọc giống chống chịu, học, xử lý bệnh với Thymol và tinh dầu bạc hà, chọn lọc giống chống chịu, vv..Gồm các thí nghiệm riêng rẽ với 6 thí nghiệm.
2.2.3.2.Thử nghiệm các biện pháp phòng trừ tổng hợp ngoài đồng ruộng (diện hẹp 500m2) (diện hẹp 500m2)
Thử nghiệm các biện pháp tổng hợp (IPM) (xử lý hạt giống với chế
phẩm (Thymol và tinh dầu bạc hà….), đánh giá giống chống chịu, phân bón và bón vôi hợp lý, vệ sinh đồng ruộng…). Gồm các các thử nghiệm phòng trừ và bón vôi hợp lý, vệ sinh đồng ruộng…). Gồm các các thử nghiệm phòng trừ đơn từng biện pháp và tổng hợp các biện pháp với 15 thí nghiệm. Các thử nghiệm được tiến hành ở Hà Nội và Bắc Ninh.
2.2.4. Xây dựng mô hình thử nghiệm các biện pháp phòng trừ tổng hợp (IPM) bệnh HXVK trên cây cà chua (IPM) bệnh HXVK trên cây cà chua
Xây dựng mô hình phòng trừ tổng hợp bệnh HXVK ở Hà Nội và Bắc Ninh. Mô hình tăng hiệu quả kinh tế 10 - 15% và hiệu quả giảm bệnh 40 - Ninh. Mô hình tăng hiệu quả kinh tế 10 - 15% và hiệu quả giảm bệnh 40 - 50% so với ngoài mô hình.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………. 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn gây bệnh HXVK trên cà chua. HXVK trên cà chua.
* Phương pháp điều tra bệnh HXVK.
Phương pháp điều tra cơ bản và phân lập VSV gây hại theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III ấn hành 1997, 1998 của Viện pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV.
Trên ruộng cà chua, điều tra theo phương pháp 5 điểm đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 50 cây, các điểm được chọn ngẫu nhiên. Dựa trên các triệu mỗi điểm điều tra 50 cây, các điểm được chọn ngẫu nhiên. Dựa trên các triệu chứng điển hình cùng với một số phương pháp xác định nhanh trên đồng ruộng để tính số cây bị nhiễm bệnh HXVK trong tổng số cây điều tra, sau đó tính tỷ lệ bệnh theo công thức: TLB(%) = B A X 100 Trong đó: TLB(%): Tỷ lệ bệnh tính bằng % A : là tổng số cây bị nhiễm bệnh HXVK B: là tổng số cây điều tra
* Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn
Theo phương pháp của Viện BVTV, 1997 (Nguyễn Văn Tuất, 1997) [19] và Kelman A., 1954.[36]. Mẫu bệnh lấy từ thân cây bị bệnh có triệu [19] và Kelman A., 1954.[36]. Mẫu bệnh lấy từ thân cây bị bệnh có triệu chứng héo rũ xanh đột ngột, ở gốc nhổ lên có màu nâu đen, có mùi cho vào túi sạch, ghi nhãn với các thông tin: nơi thu thập, giống, ngày thu mẫu... Mẫu bệnh được khử trùng rồi lấy dịch cấy lên môi trường TZC. Sau 24 - 48h chọn khuẩn lạc đơn có tâm màu hồng và xung quanh có màu trắng ngà, rìa mép hơi nhầy là đặc trưng của vi khuẩn R. solanacearum. Sau đó thử phản ứng siêu
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………. 23 nhạy trên cây thuốc lá và thử lại trên cây khoai tây để kiểm tra triệu chứng đặc trưng cho bệnh HXVK.
* Phương pháp nhuộm gram vi khuẩn R.solanacearum theo phương
pháp Hucker cải tiến: + Vật liệu, hoá chất: + Vật liệu, hoá chất:
Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g Tím kết tinh hoà tan trong 20ml Etanol 95%; 0,8g Ammon oxalat hoà tan trong 80ml nước cất. Trộn đều hai Etanol 95%; 0,8g Ammon oxalat hoà tan trong 80ml nước cất. Trộn đều hai dung dịch lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc, bảo quản trong lọ tối
Dung dịch Iod: Hoà tan 1g Iod (Iodine) trong 3 - 5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml, bảo quản trong (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml, bảo quản trong lọ tối.
Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml Etanol 95% với 30ml Aceton. 30ml Aceton.
Dung dịch nhuộm bổ sung: Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%. trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
+ Các bước tiến hành:
Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần. Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………. 24 Soi kính: dùng vật kính dầu 100x để soi.
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (–) bắt màu đỏ.
* Thí nghiệm trong phòng: các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần (5 hộp
Petri/lần nhắc)
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tạo dạng chế phẩm từ tinh dầu Bạc hà để hạn chế bệnh HXVK trên cây cà chua hạn chế bệnh HXVK trên cây cà chua
Dựa theo phương pháp sử dụng chế phẩm của Jones và CTV, (2005) [34] trường đại học Florida, Mỹ. trường đại học Florida, Mỹ.
+ Nghiên cứu, hoà tan tạo dạng chế phẩm từ tinh dầu bạc hà theo phương pháp của Văn Ngọc Hướng, 2002. pháp của Văn Ngọc Hướng, 2002.
+ Kiểm tra chất lượng của chế phẩm (hàm lượng Menthol trong chế phẩm) bởi máy sắc ký khi khối phổ (GC/MS). phẩm) bởi máy sắc ký khi khối phổ (GC/MS).
+ Xác định nồng độ và hiệu lực của chế phẩm đối với bệnh HXVK trong phòng thí nghiệm, ở nhà lưới và ngoài đồng theo phương pháp thông thường. phòng thí nghiệm, ở nhà lưới và ngoài đồng theo phương pháp thông thường.
+ Nghiên cứu thời gian và nơi bảo quản chế phẩm theo phương pháp thông thường. thông thường.
2.3.3. Phương pháp đánh giá tính chống chịu của các giống cà chua đối với bệnh HXVK với bệnh HXVK
* Thí nghiệm đánh giá tính chống chịu của các giống cà chua trong nước đối với bệnh HXVK.. bệnh HXVK..
+ Thí nghiệm được bố trí 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, 15 cây/nhắc cây/nhắc