3. Nội dung nghiên cứu
1.3.5. Giống men
1.3.5.1. Men tự nhiên
Trong lên men vang tự nhiên tương đối phức tạp và không đồng nhất. Trong môi trường nước quả tươi có các nhóm vi sinh vật khác nhau nhiễm vào từ môi trường xung quanh, thân, lá và vỏ quả trong đó phần lớn là nấm men, nấm mốc, một số ít là vi khuẩn không sinh bào tử, xạ khuẩn ... Nấm men trong dịch quả thường ít hơn nấm mốc xong lại có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn trong điều kiện yếm khí hoặc thiếu oxi, đồng thời lên men tích tụ cồn. Chính nhờ điều kiện trong dung dịch cồn sẽ làm ức chế nấm mốc, tạo điều kiện cho nấm men phát triển chiếm ưu thế trong quá trình lên men.
Các men tự nhiên hay men dại luôn có sẵn trên bề mặt của quả. Đó là một số loại như: Saccharomyces apiculata có hình múi chanh, nó có khả năng lên men tại 4÷50 rượu. Ngoài ra còn có mycoderma có khả năng phân giải acid malic thành acid lactic làm cho rượu ít bị chua gắt. Hay còn các loại khác như:
hancelnula, gichia... tạo màng trắng trên mặt rượu. Nhưng nếu để men dại phát triển tự nhiên thì quá trình lên men rất khó điều chỉnh và chất lượng rượu thu được không ổn định. Khi nền công nghiệp ngày càng phát triển thì con người đã có biện pháp cần thiết để diệt men dại và thay vào đó là nuôi cấy nấm men thuần chủng, với những đặc tính sinh học nhất định sẽ giúp cho việc chế vang đem lại hiệu quả và chất lượng cao.
1.3.5.2. Men nhân tạo
Đối với các loại quả không có hay số lượng rất ít nấm men trên vỏ quả thì khi sản xuất rượu vang nhất thiết phải bổ sung men giống vào. Sau nhiều năm nghiên cứu người ta khẳng định khi lên men rượu vang có thể dùng men ống (phòng thí nghiệm) hoặc men bánh đều cho ra rượu vang ngon.
a. Men ống
Sở dĩ gọi men ống vì giữ trong ống nghiệm, men ở dạng tiềm sinh trên môi trường thạch. Đó là những dòng hoặc hỗn hợp dòng được phân lập từ men bánh ra hoặc ở nước ngoài mang về thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Khi sử
dụng men ống không thể cấy thẳng vào nước quả mà phải tiến hành nhân giống. Như vậy dùng men ống thì phải có phòng thí nghiệm.
Ưu điểm của men ống là dùng men thuần, đã biết rõ tính năng nên lên men đều và nhanh.
Nhược điểm là tốn công, tốn thời gian và khi nước cái men đã sẵn sàng 24÷36 giờ sau khi cấy thì phải dùng ngay vì lúc đó số lượng tế bào men sống đạt tối đa và đường sinh sản mạnh, nhưng vì lý do nào đó không dùng ngay thì men sẽ chết hoặc chuyển vào dạng tiềm sinh nên nước cái men không còn dùng được nữa, vì vậy phải chuẩn bị nước cái men và nước quả lên men phải khớp với nhau.
b. Men bánh
Men bánh là men dân gian được sản xuất ở các vùng có tập quán nấu rượu. Vì nguyên liệu dùng để chế rượu trong nhân dân là gạo nên môi trường nền là bột gạo kết hợp với một số vị thuốc bắc. Sau khi chế xong các khối men giống như bánh hình tròn, dẹt và mặt trên phủ một lớp trấu làm cho khối men xốp. Men bánh có thể bóp vụn rồi rây để loại các tạp chất, sau đó bỏ thẳng vào nước quả trộn đều.
Ưu điểm cơ bản của men bánh là dễ kiếm, không như men ống muốn dùng phải có phòng thí nghiệm. Nếu sản xuất ít thì dùng lượng men nhỏ vì vậy sử dụng men bánh sẽ thích hợp.
Nhược điểm của men bánh là phức tạp, lên men chậm và kéo dài thời gian hơn men ống, chất lượng cũng không ổn định do những chất phụ, độn mỗi nơi cũng khác nhau như quế, hồi ... làm cho rượu vang có mùi vị lạ.
1.4. QUÁ TRÌNH LÊN MEN [7], [8], [11] 1.4.1. Bản chất của quá trình lên men 1.4.1. Bản chất của quá trình lên men
Lên men là một quá trình oxi hóa khử xảy ra trong cơ thể sinh vật nhằm cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật, bởi cơ thể sống luôn cần năng lượng đó được tàn trữ dưới dạng ATP.
Các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men là phản ứng tách và vận chuyển hydro ở dạng (H++e) dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase. Trong quá trình đó hydro được tách ra khỏi cơ chất chuyển đến tiếp nhận cuối cùng là chất
hữu cơ. Hợp chất hữu cơ đó khử tạo thành sản phẩm lên men rồi tích tụ lại trong môi trường dinh dưỡng. Tùy theo sản phẩm nào chiếm ưu thế mà ta có lên men rượu, lên men lactic...
Vì vậy bản chất của quá trình lên men là quá trình oxi hóa khử được xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác dụng của hệ thống enzyme, cho nên quá trình lên men còn được gọi là quá trình oxi hóa khử sinh học.
Lên men khác với hô hấp yếm khí và hô hấp hiếu khí. Hô hấp yếm khí được tiến hành trong điều kiện không có oxi tham gia, hydro được chuyển qua mạch hô hấp đến chất tiếp nhận cuối cùng như nitrat hoặc sunfat. Hô hấp hiếu khí được tiến hành trong điều kiện có oxi tham gia, hydro được chuyển qua mạch hô hấp đến chất tiếp nhận cuối cùng là oxi tạo thành nước. Còn lên men có thể thực hiện cả trong điều kiện yếm khí và hiếu khí, nhưng hydro được chuyển qua hệ thống enzyme oxi hóa khử và chất tiếp nhận cuối cùng là một chất hữu cơ, chất hữu cơ bị khử thành sản phẩm lên men tích lũy trong môi trường. Tuy nhiên lên men và quá trình hô hấp đều là quá trình oxi hóa khử sinh học.
Sự khác nhau giữa quá trình oxi hóa khử sinh học và quá trình đốt cháy các vật liệu tương tự trong lò hay nhiệt lượng kế mặc dù các cơ chất ban đầu và các sản phẩm cuối cùng giống nhau. Khi đốt cháy, năng lượng tỏa cùng một lúc dưới dạng nhiệt, trong khi đó lên men và hô hấp chỉ một phần năng lượng ra dưới dạng nhiệt. Phần nhiệt chủ yếu được tích lũy dưới dạng những hợp chất phospho giàu năng lượng hoặc trong các liên kết cao năng, từ đó có thể chuyển thành hóa năng hoặc cơ năng để cung cấp cho hoạt động sống. Hợp chất giàu năng lượng quan trọng của cơ thể là ATP. Trong cơ thể sinh vật sự tích lũy năng lượng và giải phóng năng lượng sử dụng cho hoạt động cơ thể là những quá trình thuận nghịch theo sơ đồ sau:
Oxi hóa khử sinh học Năng lượng ADP + H3PO4 ATP
Năng lượng Cung cấp cho hoạt động của cơ thể Như vậy lên men và hô hấp tế bào là quá trình oxi hóa khử sinh học. Qua đó tế bào sinh vật thu được năng lượng.
1.4.2. Cơ chế của quá trình lên men
Quá trình lên men rượu là quá trình biến đổi các chất có đường thành ethanol, CO2 dưới tác dụng của nấm men. Nấm men thực hiện quá trình thủy phân đường đôi thành đường đơn. Cơ chế của phản ứng lên men rất phức tạp, bao gồm một chuỗi các phản ứng.
Hình 1.4: Sơ đồ chuyển hóa Embden – Meyerhol – Parnas P Glucosephosphat ADP Phosphoglucose isomerase ATP Hexokinase ee H2O ATP Hexokinase ADP H2O Glucose-6-phosphat Fructose-6-phosphat Glycerin + H3PO4 Fructose-1,6-diphosphat P Aldotase Phosphofructokinase ATP Triozophosphat izomerase NADH2 NAD
Dihydro aceton phosphat Glyceraldehyt-3-phosphat
Glycerophotphat dehydrogenase Glyceraldehyt phosphate dehydrogenase ADP NAD NADH2 Glycerophosphat Axit-1,3-diphosphoglyceric Phosphatase Photphoglyceratmutase Phosphoglycerat mutase Axit-3-photphoglyceric Enoiase - H2O ATP ADP Pyruvatkinase Pyruvate decacboxylase Axit phosphoenolpyruvic Axit pyruvic Axit-2-phosphoglyceric Aldodeshydrogenase Ethanal Ethanol
Ở nấm men Saccharomyces cerevisae trong điều kiện yếm khí thì axit pyruvic chuyển thành rượu etylic theo các phản ứng sau:
Decacboxylase CH3-C-COOH CH3-CHO O -CO2 CH3-CHO CH3-CH2-OH NADH2 NAD
Như vậy sản phẩm chính của quá trình lên men là rượu etylic và CO2. Ngoài ra, trong quá trình lên men còn có nhiều sản phẩm khác được tạo thành như: glycerin, rượu bậc cao, axit hữu cơ, este và aldehyt.
- Glycerin: Trong quá trình lên men thì glycerin luôn được tạo thành đồng thời với rượu etylic. Ở phản ứng thứ 4 trong sơ đồ Embden – Meyerhol – Parnas sau khi tạo ra dihydroaxetonphosphat, phản ứng có thể sẽ tiến triển theo chiều hướng khác nếu các yếu tố bên ngoài thay đổi. Từ hợp chất này dưới sự xúc tác của enzyme glycerophotphat dehydrogenase sẽ tạo ra glycerophosphat. Sau đó với sự có mặt của phosphatase thì glycerin và axit phosphoric được tạo thành.
- Rượu bậc cao: Sản phẩm rượu bậc cao được tạo thành do sự chuyển axit amin và axit pyruvic trong cơ thể nấm men, hay do quá trình tổng hợp, hay chuyển hóa một số axit amin bởi hoạt động sống của tế bào nấm men.
Các loại rượu bậc cao một nhóm định chức là cấu tử chủ yếu của dầu fuzel. Ở trong dầu fuzel còn có thêm các loại axit bay hơi, este và aldehyt.
- Axit hữu cơ: Là sản phẩm bậc cao thường trực của quá trình lên men rượu và quá trình trao đổi dinh dưỡng nitơ trong tế bào nấm men.
- Este: Là sản phẩm bậc hai không thường trực của quá trình lên men. Nó không phải là sản phẩm tạo thành từ các hoạt động sống của tế bào nấm men mà là kết quả giữa sự tương tác giữa các sản phẩm bậc hai thường trực (este hóa các axit bay hơi và không bay hơi với các loại rượu khác nhau).
- Aldehyt: Là sản phẩm bậc hai thường trực của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể tạo thành qua con đường oxi hóa các loại rượu.
1.4.3. Các giai đoạn lên men rượu vang 1.4.3.1. Giai đoạn hình thành rượu 1.4.3.1. Giai đoạn hình thành rượu
Là giai đoạn từ lúc cấy men giống vào, cho lên men đến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh. Nếu giữ được nhiệt độ ổn định, thời gian lên men kéo dài 4÷5 ngày. Kết quả của giai đoạn này người ta gọi là “vang non”.
Trong thời gian này nấm men hoạt động mạnh nhất, tiêu thụ nguyên liệu (đường, vitamin, đạm) mạnh, biến đường thành rượu, giải phóng CO2. Kết thúc giai đoạn này thành phần nước quả thay đổi rất lớn.
1.4.3.2. Giai đoạn phát triển
Khi kết thúc lên men ở giai đoạn hình thành rượu, người ta tiến hành gạn cặn, tách xác quả bằng phương pháp lọc (đối với vang đỏ). Trong cơ sở lên men ở qui mô lớn người ta dùng hệ thống ống xiphông để hút dịch lên men sang bình hay bể lên men khác. Đây là lần gạn thứ nhất.
Khi được “vang non” thì tiếp tục cho lên men, nhưng ở giai đoạn này quá trình lên men xảy ra không ồ ạt nhưng để phân hủy những gam đường cuối cùng nên gọi là lên men phụ. Đồng thời ở giai đoạn này có quá trình lên men malolactic. Kết quả quá trình này thì axit malic được chuyển thành axit lactic làm cho rượu chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu, CO2 còn tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng ít dần. Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác men lắng xuống đáy bình hay bể.
Tiếp theo, thực hiện gạn cặn lần hai (sau lần một khoảng 20÷30 ngày), lần ba (sau lần hai khoảng 30 ngày). Nếu rượu còn đục ta lại gạn tiếp để có dung dịch trong suốt. Sau lần gạn cuối cùng rượu cơ bản ổn định về thành phần.
Ở giai đoạn này nếu nếm thử ta thấy rượu chưa thể uống được vì có vị cay, đắng, hơi chua. Ta gọi là “vang sống”.
Sau mỗi lần gạn cặn thì các dụng cụ đựng dung dịch lên men như chai, bình được đổ đầy dịch lên men, tạo điều kiện lên men yếm khí nghiêm ngặt hơn. Đến lần cuối cùng đậy kín hoàn toàn, tạo sự cách ly nghiêm ngặt với oxi.
1.4.3.3. Giai đoạn vang “chín”
Sau giai đoạn hai, “rượu non” đã ổn định thành phần nhưng rượu vẫn còn “sống” nên phải áp dụng một số biện pháp kỹ thuật để làm tăng chất lượng của rượu, để rượu được “chín”.
Trong thời gian chuyển từ rượu vang “sống” sang rượu vang chín đã xảy ra rất nhiều biến đổi sinh hóa phức tạp để chuyển từ rượu ít ngọt, ít thơm có vị chua lấn át, có vị đắng của CO2, của aldehyt sang rượu chín trong vắt, có màu đỏ hoặc vàng, có vị chua - ngọt cân đối của cồn - đường, vị đắng nhẹ của glycerin, vị chát của polyphenol. Khi có đầy đủ những tính chất như vậy ta được rượu thành phẩm.
1.4.4. Theo dõi quá trình lên men qua các chỉ tiêu sau
- Hàm lượng đường: Khi lên men phải tạo điều kiện cho nấm men hoạt động mạnh, cho lên men nhanh tiêu thụ hết đường. Vì vậy cần theo dõi hàm lượng đường thay đổi trong quá trình lên men. Nếu vì một lý do nào đó men ngưng hoạt động, trong môi trường còn nhiều đường khử, các vi sinh vật khác (không phải nấm men) phát triển dễ dàng, đưa đến thành phần rượu không còn như bình thường.
- Nhiệt độ: Nếu thực hiện lên men trong những thiết bị có dung tích lớn, người sản xuất phải đo nhiệt độ vài lần trong ngày vì trong quá trình lên men nhất là giai đoạn đầu quá trình lên men mạnh, sủi bọt nhiều, năng lượng tỏa ra nhiều, lúc ấy nhiệt cũng tăng nhiều. Quá trình lên men thích hợp vào khoảng nhiệt độ từ 20÷300C.
- Hàm lượng oxi: Mặc dù lên men là một quá trình yếm khí nhưng nhất thiết trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho nước quả tiếp xúc với oxi không khí bằng cách sục khí nhằm cung cấp oxi cho nấm men tiếp tục tăng sinh khối. Giai đoạn sau cho lên men yếm khí.
1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện hoạt động của nấm men 1.4.5.1. Ảnh hưởng của oxi 1.4.5.1. Ảnh hưởng của oxi
Mặc dù lên men rượu là một quá trình yếm khí, nhưng khi cho lên men nhất thiết trong giai đoạn đầu phải cho dịch quả tiếp xúc với oxi của không khí. Nếu nấm men có thể lên men trong điều kiện thiếu oxi là do trong tế bào nấm men còn có những chất chứa nhiều oxi, hoặc trong nước quả có các chất peroxít có thể nhường lại oxi cho nấm men.
Yêu cầu oxi cao nhất khi lên men bắt đầu, số lượng tế bào tăng nhanh. Do đó khi sản xuất nước cái men để cấy vào nước quả người ta thường áp dụng các biện pháp tăng oxi cho nước cái men bằng cách lắc cơ giới cho oxi tan nhanh vào nước hay dùng bơm để bơm thêm oxi vào nước. Khi lên men những lượng nước quả lớn có khả năng thiếu oxi và lên men chậm lại thì người ta rút nước quả ra rồi đổ trở lại lên phía trên bể nhằm làm tăng oxi cho nước quả đang lên men. Tăng oxi chỉ có lợi trong giai đoạn đầu, ở giai đoạn sau khi lượng cồn etylic tăng lên và một số chất đã sử dụng hết thì dù có oxi men cũng không thể sinh sản mạnh, lên men cũng không nhanh thêm.
1.4.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng tới cấu trúc của protein enzyme do đó ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme và ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của nấm men. Vì vậy, nhiệt độ lên men ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ lên men và độ cồn đạt được.
Trong giới hạn từ 150C đến 350C, nhiệt độ càng cao thì giai đoạn từ khi cấy men đến khi những bọt CO2 đầu tiên xuất hiện càng ngắn, lên men càng nhanh và kết thúc sớm. Nhưng nhiệt độ cao quá thì lên men càng hạn chế, độ cồn càng hạn chế, lượng đường còn lại trong rượu nhiều.
Tốt nhất nên cho lên men ở cùng một nhiệt độ, càng ổn định càng tốt. Dưới 150C lên men chậm, trên 400 men chết.
1.4.5.3. Ảnh hưởng của đường, đạm, muối khoáng và pH nước quả a. Đường a. Đường
Đường cung cấp năng lượng và nguồn cacbon cho men, dạng glucose là thích hợp nhất vì tất cả các loài men đều đồng hóa được nhưng sacharose cho vào nước quả thì cũng nhanh chóng bị các enzyme của men chuyển thành đường khử, dễ đồng hóa.
Tỷ lệ đường càng cao thì rượu càng nhiều cồn etylic cho nên thêm đường