b. Men bánh
1.4.3. Các giai đoạn lên men rượu vang
1.4.3.1. Giai đoạn hình thành rượu
Là giai đoạn từ lúc cấy men giống vào, cho lên men đến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh. Nếu giữ được nhiệt độ ổn định, thời gian lên men kéo dài 4÷5 ngày. Kết quả của giai đoạn này người ta gọi là “vang non”.
Trong thời gian này nấm men hoạt động mạnh nhất, tiêu thụ nguyên liệu (đường, vitamin, đạm) mạnh, biến đường thành rượu, giải phóng CO2. Kết thúc giai đoạn này thành phần nước quả thay đổi rất lớn.
1.4.3.2. Giai đoạn phát triển
Khi kết thúc lên men ở giai đoạn hình thành rượu, người ta tiến hành gạn cặn, tách xác quả bằng phương pháp lọc (đối với vang đỏ). Trong cơ sở lên men ở qui mô lớn người ta dùng hệ thống ống xiphông để hút dịch lên men sang bình hay bể lên men khác. Đây là lần gạn thứ nhất.
Khi được “vang non” thì tiếp tục cho lên men, nhưng ở giai đoạn này quá trình lên men xảy ra không ồ ạt nhưng để phân hủy những gam đường cuối cùng nên gọi là lên men phụ. Đồng thời ở giai đoạn này có quá trình lên men malolactic. Kết quả quá trình này thì axit malic được chuyển thành axit lactic làm cho rượu chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu, CO2 còn tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng ít dần. Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác men lắng xuống đáy bình hay bể.
Tiếp theo, thực hiện gạn cặn lần hai (sau lần một khoảng 20÷30 ngày), lần ba (sau lần hai khoảng 30 ngày). Nếu rượu còn đục ta lại gạn tiếp để có dung dịch trong suốt. Sau lần gạn cuối cùng rượu cơ bản ổn định về thành phần.
Ở giai đoạn này nếu nếm thử ta thấy rượu chưa thể uống được vì có vị cay, đắng, hơi chua. Ta gọi là “vang sống”.
Sau mỗi lần gạn cặn thì các dụng cụ đựng dung dịch lên men như chai, bình được đổ đầy dịch lên men, tạo điều kiện lên men yếm khí nghiêm ngặt hơn. Đến lần cuối cùng đậy kín hoàn toàn, tạo sự cách ly nghiêm ngặt với oxi.
1.4.3.3. Giai đoạn vang “chín”
Sau giai đoạn hai, “rượu non” đã ổn định thành phần nhưng rượu vẫn còn “sống” nên phải áp dụng một số biện pháp kỹ thuật để làm tăng chất lượng của rượu, để rượu được “chín”.
Trong thời gian chuyển từ rượu vang “sống” sang rượu vang chín đã xảy ra rất nhiều biến đổi sinh hóa phức tạp để chuyển từ rượu ít ngọt, ít thơm có vị chua lấn át, có vị đắng của CO2, của aldehyt sang rượu chín trong vắt, có màu đỏ hoặc vàng, có vị chua - ngọt cân đối của cồn - đường, vị đắng nhẹ của glycerin, vị chát của polyphenol. Khi có đầy đủ những tính chất như vậy ta được rượu thành phẩm.
1.4.4. Theo dõi quá trình lên men qua các chỉ tiêu sau
- Hàm lượng đường: Khi lên men phải tạo điều kiện cho nấm men hoạt động mạnh, cho lên men nhanh tiêu thụ hết đường. Vì vậy cần theo dõi hàm lượng đường thay đổi trong quá trình lên men. Nếu vì một lý do nào đó men ngưng hoạt động, trong môi trường còn nhiều đường khử, các vi sinh vật khác (không phải nấm men) phát triển dễ dàng, đưa đến thành phần rượu không còn như bình thường.
- Nhiệt độ: Nếu thực hiện lên men trong những thiết bị có dung tích lớn, người sản xuất phải đo nhiệt độ vài lần trong ngày vì trong quá trình lên men nhất là giai đoạn đầu quá trình lên men mạnh, sủi bọt nhiều, năng lượng tỏa ra nhiều, lúc ấy nhiệt cũng tăng nhiều. Quá trình lên men thích hợp vào khoảng nhiệt độ từ 20÷300C.
- Hàm lượng oxi: Mặc dù lên men là một quá trình yếm khí nhưng nhất thiết trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho nước quả tiếp xúc với oxi không khí bằng cách sục khí nhằm cung cấp oxi cho nấm men tiếp tục tăng sinh khối. Giai đoạn sau cho lên men yếm khí.
1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện hoạt động của nấm men 1.4.5.1. Ảnh hưởng của oxi 1.4.5.1. Ảnh hưởng của oxi
Mặc dù lên men rượu là một quá trình yếm khí, nhưng khi cho lên men nhất thiết trong giai đoạn đầu phải cho dịch quả tiếp xúc với oxi của không khí. Nếu nấm men có thể lên men trong điều kiện thiếu oxi là do trong tế bào nấm men còn có những chất chứa nhiều oxi, hoặc trong nước quả có các chất peroxít có thể nhường lại oxi cho nấm men.
Yêu cầu oxi cao nhất khi lên men bắt đầu, số lượng tế bào tăng nhanh. Do đó khi sản xuất nước cái men để cấy vào nước quả người ta thường áp dụng các biện pháp tăng oxi cho nước cái men bằng cách lắc cơ giới cho oxi tan nhanh vào nước hay dùng bơm để bơm thêm oxi vào nước. Khi lên men những lượng nước quả lớn có khả năng thiếu oxi và lên men chậm lại thì người ta rút nước quả ra rồi đổ trở lại lên phía trên bể nhằm làm tăng oxi cho nước quả đang lên men. Tăng oxi chỉ có lợi trong giai đoạn đầu, ở giai đoạn sau khi lượng cồn etylic tăng lên và một số chất đã sử dụng hết thì dù có oxi men cũng không thể sinh sản mạnh, lên men cũng không nhanh thêm.
1.4.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng tới cấu trúc của protein enzyme do đó ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme và ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của nấm men. Vì vậy, nhiệt độ lên men ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ lên men và độ cồn đạt được.
Trong giới hạn từ 150C đến 350C, nhiệt độ càng cao thì giai đoạn từ khi cấy men đến khi những bọt CO2 đầu tiên xuất hiện càng ngắn, lên men càng nhanh và kết thúc sớm. Nhưng nhiệt độ cao quá thì lên men càng hạn chế, độ cồn càng hạn chế, lượng đường còn lại trong rượu nhiều.
Tốt nhất nên cho lên men ở cùng một nhiệt độ, càng ổn định càng tốt. Dưới 150C lên men chậm, trên 400 men chết.
1.4.5.3. Ảnh hưởng của đường, đạm, muối khoáng và pH nước quả a. Đường a. Đường
Đường cung cấp năng lượng và nguồn cacbon cho men, dạng glucose là thích hợp nhất vì tất cả các loài men đều đồng hóa được nhưng sacharose cho vào nước quả thì cũng nhanh chóng bị các enzyme của men chuyển thành đường khử, dễ đồng hóa.
Tỷ lệ đường càng cao thì rượu càng nhiều cồn etylic cho nên thêm đường là một biện pháp rất phổ biến. Hàm lượng đường thích hợp cho quá trình lên men là 200÷220 g/l. Ít đường thì dễ lên men nhưng độ rượu thấp, đường cao thì gây khó khăn cho hoạt động của nấm men.
b. Đạm
25÷60% khối lượng khô của men là những chất đạm, vì vậy trong nước quả phải có đủ đạm để men sinh sản nhanh và cường độ lên men tăng theo. Khi tỷ lệ đạm trong men tăng gấp đôi thì khả năng lên men tăng 50%.
Thường trong nước quả có đủ độ đạm để cung cấp cho nhu cầu của men nhưng cũng có trường hợp không đủ do một nguyên nhân nào đó mà tỉ lệ đạm thấp thì phải thêm đạm. Đối với chủng Saccharomyces, nguồn nitơ là muối amoni là thích hợp nhất vì men đồng hóa được các dạng muối này. Từ muối amoni men có thể tổng hợp được tất cả các acid amin và protein cần thiết cho mình, nhưng nếu cho thêm acid amin dưới dạng hỗn hợp nhiều loại thì tác dụng kích thích rất rõ.
c. Muối khoáng
Muối khoáng cần thiết cho men để cấu thành tổ chức của mình và cần thiết để cấu thành enzyme, là tác nhân gây ra các phản ứng sinh hóa trong rượu.
Ngoài ra còn một lượng nhỏ các chất Al, Br2, Cr, Cu, Pb, Mn, Ag, Zn, Sn... tất cả các muối khoáng chiếm 5÷10% khối lượng khô của men.
d. Độ pH
Các chủng nấm men trong quá trình sinh sản và phát triển chịu ảnh hưởng lớn của pH môi trường. Men chỉ hoạt động trong những giới hạn pH nhất định. Người ta thấy cho lên men những nước quả chua thì rượu ngon hơn và từ đó nghĩ
rằng pH thấp tốt hơn pH cao. Thực ra pH tối thích đối với Saccharomyces là 4÷6. Độ pH nước quả từ 2,8÷3,8 không phải là tối thích nhưng men vẫn hoạt động tốt còn khuẩn lạc thì bị ức chế. Do đó, người chế rượu hay dùng nước quả có độ pH từ 3,0÷3,5 thì không gây cản trở hoạt động của men nhưng nếu vì những điều kiện khác không thuận lợi như thiếu oxi, nhiệt quá cao men ngừng hoạt động thì rượu cũng không bị khuẩn làm hỏng.
e. Chất kích thích men
Cũng như các sinh vật cao cấp, men cần một số chất kích thích, trước hết là vitamin để sinh sản và hoạt động. Một số loài men có thể tổng hợp được những vitamin nhất định do lấy nguyên liệu từ các chất hữu cơ trong nước quả. Những vitamin khác thì men không tự tổng hợp được mà không có sẵn trong nước quả thì men ngừng hoạt động.
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU QUẢ XƯƠNG RỒNG [15], [16], [17], [21] 1.5.1. Trên thế giới 1.5.1. Trên thế giới
- Chủ đề của nghiên cứu thử nghiệm máu cholesterol tài trợ của American Heart Association. Các nghiên cứu khoa học đã được tiến hành trên những đặc tính kháng virus của xương rồng bà để điều trị mụn rộp, cúm, và HIV, cũng như việc sử dụng nó trong điều trị bệnh béo phì, rối loạn dạ dày-ruột, và các bệnh da.
- Nước Mexico đã sản xuất ra nước giải khát nopalea và lên men rượu từ quả xương rồng bàn chải.
- Pectin và chất nhày của quả xương rồng bàn chải có lợi cho hệ tiêu hóa, hoa được dùng để trị tiêu chảy, đau bụng, các triệu chứng khó chịu đường ruột và chống ung loét bao tử đã được nghiên cứu tại Messina-Ý (Journal of Ethnopharmacology Số 76-Jan 2001).
- Dịch chiết từ quả bằng ethanol cho thấy có hoạt tính bảo vệ niêm mạc ống tiêu hóa, làm giảm đau, ức chế sự di chuyển của leukocyte nơi chuột bị gây phù bằng carrageenan, đồng thời cũng ức chế sự phóng thích beta-glucuronidase (một loại enzym lysosomal có trong neutrophil của chuột) (Archive of Pharmacology Research Số 21-1998).
- Dịch chiết từ quả xương rồng (liều 100-400mg/kg, tiêm qua màng phúc toan) có hoạt tính chống phản ứng sưng gây ra nơi chân chuột bị chích carrageenan, tác dụng cũng tùy thuộc liều sử dụng : các phản ứng khi chạm vào vật nóng bị ức chế khi dùng liều 100 mg/kg. (Journal of Ethnopharmacology Số 67-1999).
- Trong thập niên 1990, nhiều nhà khoa học đã kéo về khá đông ở vùng này và phải mất gần 10 năm mới tìm ra nguyên nhân và phân lập các yếu tố tác dụng của cây xương rồng và đến 4/1997, công trình mới được cấp quyền bảo hộ cho yếu tố hoạt tính sinh học trên có tên là P57. Giấy phép khai thác và kinh doanh được cấp cho Công ty Dược phẩm Anh: Phytopharma. Và sau đó(8/1998), công ty này kết hợp với Tập đoàn Dược phẩm Pfizer (Mỹ) đầu tư hàng trăm triệu đô la vào nghiên cứu loại thuốc giảm béo này. Qua thử nghiệm thấy P57 có khả năng làm giảm 1000-2000 calori/ngày, bằng cách tạo ra cảm giác no và dường như không có tác dụng phụ. Qua thử nghiệm trên chuột và trên những người tình nguyện, sản phẩm có nhiều hứa hẹn với một thị trường có doanh số khoảng 3 tỷ đô-la/năm (vì số người mập trên thế giới khá đông đảo). Tuy rằng, sau này Pfizer rút khỏi dự án (7/2003).
1.5.2. Trong nước [20]
- Đại học Huế đã xác định các thành phần sinh hóa trong xương rồng bàn chải.
- Viện ứng dụng công nghệ tại TP.HCM đã trồng thành công 1ha tại Phước Long - Bình Phước và đang có kế hoạch mở rộng phát triển giống này trong năm 2007.
Chương 2
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu chính [16], [17], [20]
Quả xương rồng bàn chải được thu hái ở xã Bình Kiến-Tuy Hòa-Phú Yên. Yêu cầu quả thu hái phải đạt độ chín kỹ thuật: Chín đều toàn quả, hàm lượng đường đạt từ 9-110brix.
Đạt tối đa là 30 quả/kg. Hình 2.1: Quả xương rồng
bàn chải 2.1.2. Nguyên liệu phụ và hóa chất
2.1.2.1. Nấm men
Để chế biến rượu vang từ quả xương rồng nên dùng chủng nấm men
Sacchromyces cerevisiae được giữ trong ống nghiệm, men ở dạng tiềm sinh, trên môi trường thạch. Chủng nấm men này được cung cấp bởi bộ môn hóa sinh – vi sinh trường đại học Nha Trang.
Hình 2.2: Nấm men
Saccharomyces cerevisiae
2.1.2.2. Đường
Đường sử dụng nhằm mục đích làm tăng hàm lượng đường của dịch quả trước khi đưa vào lên men. Đường sử dụng trong sản xuất rượu này là đường cát trắng Biên Hòa, yêu cầu đường phải đạt:
- Hàm lượng đường saccarose > 99%. - Hàm lượng nước < 0,2%.
- Đường không lẫn tạp chất, hàm lượng đường khử < 0,1%
- Hàm lượng tro < 0,03%.
Hình 2.3: Đường cát trắng Biên Hòa
2.1.2.3. Axit citric
Dùng để điều chỉnh pH của dịch quả trước khi lên men. Axit citric được dùng phải đạt yêu cầu sau:
- Hàm lượng axit citric >99%. - Hàm lượng nước < 0,2%.
- Dạng tinh thể không lẫn tạp chất. Hình 2.4: Axit citric 2.1.2.4. Enzyme pectinase
Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm của enzyme pectinase, có nguồn gốc từ nấm mốc
Aspergillus aculeatus, là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt liên kết glucosid 1,4 trong mạch pectin tạo ra axit galacturonic. Một số đặc tính của enzyme:
- Enzyme hoạt động tối thích ở pH khoảng 4,5.
- Enzyme có màu nâu và mùi nhẹ đặc trưng của sản phẩm lên men.
- Bảo quản thích hợp ở nhiệt độ là 0÷100C, khi bảo quản ở 200C hoạt độ của nó duy trì trong 3 tháng.
Hình 2.5: Enzyme pectinase
2.1.3. Các thiết bị và dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm
Máy đo pH, khúc xạ kế, cân kỹ thuật, buồng đếm Thomas, máy lắc, nồi hấp, tủ sấy tiệt trùng, thiết bị chưng cất đơn giản, …
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Quy trình dự kiến 2.2.1. Quy trình dự kiến
Rượu vang từ quả xương rồng bàn chải là vang đỏ tức là dùng phương pháp lên men có xác quả nên quy trình dự kiến sản xuất vang đỏ từ quả xương rồng bàn chải như sau
Phân loại Rửa Làm dập
Đường, axit citric Nấm men Enzyme pectinase Lên men ethanol
Làm trong, gạn cặn Điều chỉnh thành phần
Xương rồng
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu chính: pH, hàm lượng chất khô, khoáng, hàm lượng ẩm.
- Nuôi tăng sinh nấm men và đếm số lượng tế bào nấm men.
- Nghiên cứu tối ưu hóa công đoạn lên men: Nồng độ đường, pH, tỷ lệ nấm men, thời gian lên men.
- Nghiên cứu xác định tỷ lệ bổ sung enzyme pectinase để làm trong. - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả xương rồng bàn chải. - Sơ bộ tính giá thành.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm
2.2.3.1. Nuôi tăng sinh nấm men
Xương rồng bàn chải Rửa
Xử lý Ép
Dịch quả Đường, axit citric, vitamin B1, amonsunfat ([đường]= 10÷12%, pH=4,5)
Thanh trùng (1000C, ح = 15 phút)
Môi trường nuôi nấm men men giống Nước cái men
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa cho công đoạn lên men ethanol
Phương pháp bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm yếu tố toàn phần N=2k để tìm phương trình thể hiện mối liên hệ giữa hàm mục tiêu với các yếu tố ảnh hưởng là hàm bậc 1. Dựa vào kết quả thí nghiệm để kiểm định tính phù hợp của mô hình đã chọn. Nếu mô hình không phù hợp thì bổ sung thêm thí nghiệm để tìm phương trình bậc 2, sử dụng phương pháp mặt đáp ứng cấu trúc hợp tử tại tâm (Central composite).
Thời gian lên men từ 6÷10 ngày Tỷ lệ nấm men từ 8÷12% pH=4,2÷4,8 Công đoạn lên men Độ cồn Hàm lượng đường từ 19÷25 0Brix
- Ma trận thực nghiệm theo mô hình bậc 1 được bố trí như sau: N U1 U2 U3 U4 1 19 4,2 8 6 2 25 4,2 8 6 3 19 4,8 8 6 4 25 4,8 8 6 5 19 4,2 12 6 6 25 4,2 12 6 7 19 4,8 12 6 8 25 4,8 12 6 9 19 4,2 8 10