500 - 1% HCL.
b. K t qu kh o sát nh h ng c a t l dung môi và nguyên li u đ n kh n ng trích ly Anthocyanin
Trích ly là quá trình hòa tan ch n l c m t hay nhi u c u t có trong m u nguyên li u b ng cách cho nguyên li u ti p xúc v i dung môi. ng l c c a quá trình trích ly là s chênh l ch n ng đ c a c u t trong nguyên li u trong dung môi. T l gi a nguyên li u và dung môi nh h ng r t l n đ n quá trình trích ly. Vì v y chúng tôi ti n hành kh o sát t l gi a dung môi và nguyên li u trong quá trình trích ly. K t qu nh h ng c a t l dung môi và nguyên li u đ c th hi n trong b ng 9.
B ng 3.3: nh h ng c a t l dung môi và nguyên li u đ n kh n ng trích lyAnthocyanin Anthocyanin
T l nguyên li u v : dung môi (g/ml) Hàm l ng Anthocyanin (g)
1:20 0,0183e 1:30 0,0210d 1:40 0,0227c 1:50 0,0243b 1:60 0,0263a 1:80 0,0267a
Trong cùng m t c t các s có cùng ch s không khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th
Duncan.
Qua b ng 3.3 cho th y t l dung môi và nguyên li u nh h ng t i quá trình trích ly.
Khi t ng t l nguyên li u: dung môi là 1:20 đ n 1:80 thì hàm l ng Anthocyanin thu đ c sau quá trình trích lyt ng.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 47 các m c t l 1:20; 1:30; 1:40; 1:50 thì hàm l ng Anthocyanin thu đ c l n l t là 0,0183g, 0,0210g, 0,0227g, 0,0243g. Các t bào d ng u tr ng nh ng l ng dung môi dùng đ trích ly ít, chênh l ch n ng đ c a c u t c n trích ly v i dung môi th p, n ng đ c a ch t chi t trong nguyên li u và dung môi chi t d n đ t tr ng thái cân b ng. Vì v y, ch t chi t không đ c thu h i tri t đ , hàm l ng Anthocyanin th p.
m c t l 1:60 và 1:80 thì l ng ch t màu Anthocyanin thu đ c l n l t là 0,0263g và 0,0267g. t l này, s chênh l ch n ng đ c a các c u t c n trích ly trong nguyên li u và dung môi l n. Do đó, ch t chi t đ c trích ly vào dung môi tri t đ d n đ n hàm l ng Anthocyanin thu đ c nhi u.
m c t l 1:80 thì l ng ch t màu Anthocyanin thu đ c nhi u nh t tuy nhiên không có s khác bi t có Ủ ngh a so v i t l 1:60. Nguyên nhân là do lúc này l ng ch t màu tan vào dung môi đã đ t t i đa và s t ng l ng ch t màu là không đáng k khi t ng l ng dung môi trích ly. Nh v y, t l nguyên li u : dung môi là 1:60 là phù h p gi a kh i l ng nguyên li u và dung môi.
c. K t qu kh o sát nh h ng c a nhi t đ đ n kh n ng trích ly Anthocyanin
Sau khi tìm đ c h dung môi và t l gi a nguyên liêu : dung môi. Ti n hành kh o sát nh h ng c a nhi t đ trong quá trình trích ly. K t qu nh h ng c a nhi t đ đ n kh n ng trích ly Anthocyanin đ c th hi n trong b ng 3.4.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 48 B ng 3.4: nh h ng c a nhi t đ đ n kh n ng trích ly Anthocyanin Nhi t đ ( 0 C) Hàm l ng Anthocyanin (g) 30 0,0270c 40 0,0283bc 50 0,0313a 60 0,0290b 70 0,0237d
Trong cùng m t c t các s có cùng ch s không khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th
Duncan.
D a vào hàm l ng Anthocyanin thu đ c b ng 3.4 ta th y khi trích ly các nhi t đ là 300
C, 400C, 500C, cùng v i m t l ng nguyên li u, cùng m t th i gian nh ng khi t ng nhi t đ thì hàm l ng Anthocyanin thu đ c sau quá trình trích ly s t ng lên. B i vì khi t ng nhi t đ , các c u t s chuy n đ ng nhanh h n, do đó s hoà tan và khu ch tán c a các c u t t nguyên li u vào dung môi s đ c t ng.
Nh ng khi ti p t c t ng nhi t đ lên 600
C, 700C thì hàm l ng Anthocyanin l i gi m. Nguyên nhân là do Anthocyanin không b n, b phân hu .
Vì v y, d a vào b ng thì nhi t đ 500
C là nhi t đ thích h p nh t cho quá trình trích ly.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 49 d. K t qu kh o sát nh h ng c a th i gian đ n kh n ng trích ly Anthocyanin K t qu nh h ng c a th i gian đ n kh n ng trích ly Anthocyanin đ c th hi n trong b ng 3.5 sau: B ng 3.5: nh h ng c a th i gian đ n kh n ng trích ly Anthocyanin Th i gian ( gi ) Hàm l ng Anthocyanin (g) 1 0,0233c 2 0,0253bc 3 0,0303a 4 0,0267b 5 0,0260b
Trong cùng m t c t các s có cùng ch s không khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th
Duncan.
Qua b ng 3.5 cho th y th i gian có nh h ng đ n hàm l ng Anthocyanin thu đ c sau quá trình trích ly.
Khi trích ly th i gian là 1 gi thì cho hàm l ng Anthocyanin th p nh t. Th i gian trích ly 3 gi thì cho hàm l ng Anthocyanin cao nh t.
Khi trích ly các kho ng th i gian là 1 gi , 2gi , 3 gi , cùng v i m t t l nguyên li u : dung môi, cùng m t nhi t đ nh ng khi càng t ng th i gian thì hàm l ng Anthocyanin thu đ c sau quá trình trích ly s càng t ng. Nguyên nhân d n đ n hi n t ng này là do khi ta càng kéo dài th i gian thì s ti p xúc gi a nguyên li u và dung môi càng dài nên các ch t trong nguyên li u s đ c trích ra ngoài tri t đ h n.
M c khác, n u th i gian trích ly quá dài (4 gi , 5 gi ) thì hàm l ng Anthocyanin thu đ c gi m do lúc này Anthocyanin đã b phân hu d i tác d ng c a các tác nhân (ánh sáng, oxy..)
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 50 Do đó ch n 3 gi là th i gian t i u cho trích lyAnthocynin t h t đ u đen. Vì v y thông qua các thí nghi m trên chúng tôi ch n các thông s h dung môi (c n 50 đ - 1% HCl), t l nguyên li u : dung môi là 1:60, v i nhi t đ là 500
C và th i gian là 3 gi thì quá trình trích lyđ t hi u qu cao nh t.
4. K t qu kh o sát ho t tính sinh h c
a. K t qu kh o sát kh n ng kháng oxy hoá
M u Anthocyanin thu sau trích ly đem ti n hành th ho t tính kháng oxy hoá b ng ph ng pháp DPPH. K t qu kh o sát đ c ghi nh n hình sau:
Hình 3.2 : th bi u di n kh n ng kháng oxy hoá
Qua hình 3.2 k t qu kh o sát ho t tính kháng oxy hoá theo ph ng pháp DPPHta th y r ng:
Khi t ng n ng đ Anthocyanin thì kh n ng kháng oxy hoá c ng t ng. T i n ng đ 0,025(mg/ml) thì ph n tr m kháng oxy hoá là th p nh t còn c n n ng đ là 0,20 (mg/ml) thì kh n ng kháng oxy hoá cao nh t. i u này đ c gi i thích nh
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 51 sau: Anthocyanin là m t h p ch t thu c polyphenol – có kh n ng kháng oxy hoá nên khin ng đ Anthocyanin t ng thì kh n ng kháng oxy hoá t ng.
th hình 3.2 c ng th hi n kh n ng kháng oxy hoá c a Anthocyanin cao h n so v i BHT (c th g p 3,23 l n so v i BHT n ng đ thí nghi m là 0,20 mg/ml) nh ng th p h n so v i vitamin C (th p h n 1,13 l n so v i vitamin C n ng đ thí nghi m là 0,20 mg/ml).
T đó k t lu n r ng kh n ng kháng oxy hoá c a m u Anthocyanin thô là khá cao (Anthocyanin b ng 87,75% so v i Vitamin C n ng đ 0,20 mg/ml).
b. Kh o sát kh n ng kháng khu n
Ho t tính kháng khu n c a m u Anthocyanin thô có liên quan ch t ch đ n phenolic (phenol đ n gi n, acid phenolic, quinon, flavonoid,…) và chúng đ c hình thành nh là ph n ng t v ch ng l i s lây nhi m c a vi khu n. ó là c s đ xác đ nh kh n ng kháng khu n c a m u Anthocyanin v i vi sinh v t ki m đ nh là Bacilluss subtilis (B.subtilis) và Escherichia coli (E.coli) trên môi tr ng NA, b ng ph ng pháp đ c l . K t qu xác đ nh đ c trình bày b ng:
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 52
B ng 3.6 : Ho t tính kháng khu n c a dch trích Anthocyanin
Vi sinh v t ki m đ nh N ng đ (mg/ml) ng kính(mm) vòng vô khu n
Escherichia coli 5 Không có hi n t ng kháng 10 15 5,67e 20 7,33d 25 8,00d 30 9,67c 35 10,67bc 40 11,67ab 45 12,67a i ch ng(N c) Không có hi n t ng Bacilluss subtilis 5 3,67h 10 5,67g 15 7,67ef 20 8,67e 25 9,67d 30 11,00c 35 12,67b 40 13,67ab 45 14,67a i ch ng(N c) Không có hi n t ng
Trong cùng m t c t, các s có cùng ch s không khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th
Duncan.
D a vào k t qu b ng 3.6 ta th y r ng Anthocyanin có kh n ng kháng khu n v i c Bacilluss subtilis và Escherichia coli nh ngkh n ng c ch vi khu n Bacilluss subtilis m nhh n đ i v i Escherichia coli. n ng đ 5(mg/ml)ch t màu Anthocyanin thô th hi n kh n ng kháng khu nv i đ ng kínhvòng kháng khu n là 3,67mm còn đ i v i vi khu n Escherichia coli thì n ng đ 5(mg/ml) không có hi n t ng kháng.
Khi t ng n ng đ Anthocyanin thì kh n ng kháng khu n t ng.
V y v im u Anthocyanin thô thì n ng đ c ch t i thi u đ i v i vi khu n Bacilluss subtilis, Escherichia coli l n l t là 5mg/ml và 15mg/ml.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 53
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 54
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 55
5. Kh o sát m t s đ c tính c a Anthocyanin thô
Sau khi ti n hành quá trình trích ly Anthocyanin t đ u đen, ta ti n hành cô quay và thu đ c Anthocyanin thô d ng b t. B t Anthocyanin thô đem kh o sát m t s đ c tính và cho k t qu nh b ng sau:
B ng 3.7: M t s đ c tính c a Anthocyanin thô.
Hình 3.5: B t Anthocyanin thô
K t qu nghiên c u đ b n mƠu anthocyanin thô nhi t đ 95-1000C B ng 3.8. Ph n tr m màu còn l i theo th i gian 95oC – 1000C
Th i gian Ph n tr m màu còn l i (%) Ban đ u 100 30 phút 95,23% 60 phút 85,50% 90 phút 76,45% 120 phút 69,10%
Khi gia nhi t đ n 95-1000C thì đ b n màu c a Anthocyanin gi m d n theo th i gian.
Khi đun nóng quá lâu v i nhi t đ cao thì các Anthocyanin có th b phá hu và m t màu.
Ch tiêu Giá trđ thu c m (%) 25 pH 2,6 Hàm l ng polyphenol 2,063g/33,57g b t Anthocyanin thô
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 56
Nghiên c u nh h ng c a pH đ n mƠu Anthocyanin thô
K t qu kh o sát s thay đ i màu c a dung d ch t i 8 pH khác nhau đ c bi u di n b ng 3.9 và hình 3.6 :
B ng 3.9: Màu c a Anthocyanin trong các pH khác nhau
pH 1 2 3 4 5 6 7 8 Màu đ m nh t H ng nh t Tím nh t Vàng cam Xanh đen Xanh rêu
Hình 3.6: Màu c a Anthocyanin theo pH
T k t qu trên b ng 3.9 vàhình 3.6 cho th y: màus cc a Anthocyanin ph thu c r t l n theo pH môi tr ng. vùng acid m nh (pH=1), Anthocyanin có màu đ . Khi pH t ng t 1-8 thì màu đ gi m d n.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 57 i u này đ c gi i thích nh sau: Trong dung d ch acid, Anthocyanin t n t i d ng cation flavylium hay d ng mu i oxonium (cation) có màucam đ n đ , pH = 4 – 5 chúng có th chuy n v d ng base Cacbinol hay hemiketal không màu, pH = 6 – 7 chuy n v d ng quinoit màu tím hay d ng chalcon màu vàng, hay không màu, pH = 7- 8 l i v d ng quinoidal anhydro (anion) có màu xanh.
Khi pH t ng d n, có s t n công c a n c vào vòng pyran Anthocyanin chuy n d n sang d ng base carbinol và hemiketal không màu. ây chính là quá trình hydrat hóa y u t chính t o nên s b c màu c a dung d ch màu - n c. Trong dung d ch base có s d ch chuy n c a H+ t -
OH nên Anthocyanin chuy n sang d ng anion có màu xanh. Khi pH môi tr ng càng cao ion H+ trong nhóm -OH còn l i b phân hu và khi y đi n t không còn và màu xanh tr nên xanh h n b i vì ánh sáng h p th tr thành đ h n. Trong môi tr ng trung tính c hai d ng cùng t n t i nên dung d ch cho màu tím.
Do Anthocyanin có tính ch t l ng tính d n đ n nh ng thay đ i màu s c ph thu c vào pH. Nh đi n tích (+) t do mà Anthocyanin trong dung d ch aicd tác d ng v i nh ng cation và t o mu i đ c v i acid, còn trong dung d ch ki m thì ch t này tác d ng nh anion và t o đ c mu i v i base. Th c t các Anthocyanin đ c s d ng nh nh ng ch t màu th c ph m. Chúng có màu s c t đ tím (hoa cà) đ n đ ng,… a ph n th c ph m có pH t h i acid đ n trung tính nên v i màu s c t Anthocyanin tách t đ u đen phù h p s d ng trong kho ng pH=3-6.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 58
K T LU N
Thông qua các thí nghi m kh o sát trong quá trình trích ly, chúng tôi đ a ra m t s k t lu n sau:
H dung môi thích h p nh t trong quá trình trích lylà h c n 500 – 1% HCl. T l nguyên li u(g) : dung môi(ml) thu đ c hàm l ng Anthocyanin cao nh t trong quá trình trích ly là 1:60.
Quá trình trích ly t i u 500C và trong th i gian 3 gi thì thu đ c hàm l ng Anthocyanin thu đ c cao nh t.
Qua kh o sát ho t tính b t g c t do DPPH cho th y Anthocyanin có ho t tính kháng oxy hoá khá cao (Anthocyanin b ng 87,75% so v i Vitamin C n ng đ 0,20 mg/ml).
M u Anthocyanin thô cón ng đ c ch t i thi u đ i v i vi khu n Bacilluss subtilis, Escherichia coli l n l t là 5mg/ml và 15mg/ml.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 59 Qua k t qu trên đã hoàn thi n quy trình trích lyAnthocyanin t h t đ u đen nh sau:
500C, t l 1:60, 3gi
Hình 4.1 : S đ hoàn thi n quy trình trích ly Anthocyanin t đ u đen Làm s ch, bóc v Trích ly L cchân không u i dung môi Ch t màu Anthocyanin thô N c C n 50 - 1% HCl N c th i, h tđ u Bã H t đ u đen Ch n l a nguyên li u Ly tâm
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 60
KI N NGH
Sau quá trình nghiên c u, chúng tôi đã rút ra đ c thông s công ngh cho quy trình trích ly Anthocyanin t đ u đen nh ng trong quá trình nghiên c u do th c hi n thí nghi m b ng ph ng pháp th công nhi u và h n ch v d ng c , thi t b nên không th tránh kh i nh ng sai s nh trong k thu t và th c hi n thí nghi m. Nh m đ t đ c m c chính xác cao h n, chúng tôi có nh ng ki n ngh sau:
Ti n hành nghiên c u thí nghi m trích ly Anthocyanin t nhi u dung môi khác nhau (methanol, c n + acid citric, …) t đó so sánh hi u su t trích ly t dung môi nào cao nh t đ có s l a ch n dung môi trích lyđem l i hi u qu kinh t .
Nghiên c u thí nghi m tinh s ch Anthocyanin đ thu nh n Anthocyanin có đ tinh khuy t cao.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 61
TẨI LI U THAM KH O
Tài li u ti ng vi t.
1. Nguy nTh Ph ng Anh, Nguy n Th Lan, Nghiênc u nh h ngc a pH đ n màu c a Anthocyanin t b p c i tím ng d ng làm ch t ch th an toàn trong phântích th cph mvà hoáh c,T pchí Khoa h c vàCôngngh ih c àN ng, S : 3(20)/2007, ...
2. Huy Bích, ng Quang Chung, Bùi Xuân Ch ng và c ng s , Cây thu c và đ ng v t làm thu c Vi t Nam t p 1, Nhà xu t b n khoa h c và k thu t, 2006,756-758.
3. Hu nh Th Kim Cúc, Ph m Châu Hu nh, Nguy n Th Lan, Tr n Khôi Uyên; Xác đ nh hàm l ng Anthocyanin trong m t s nguyên li u rau qu b ng ph ng pháp pH vi sai, T p chí khoa h c và công ngh , i h c à N ng, 3(7),