2.1. ađi m nghiên c u
Phòng thí nghi m Sinh Hoá và phòng thí nghi m Th c ph m - Tr ng i H c M Thành Ph H Chí Minh.
a ch : 68 Lê Th Trung, Phú L i, Th d u M t, Bình D ng.
2.2. Nguyên li u
u đen (Vigna cylindrica) đ c mua t i ch ình, Ph ng Phú L i, Tp Th D u M t,T nh Bình D ng.
2.3. Hoá ch t s d ng
Ngu n g c t Trung Qu c: acid gallic, BHT, cao n m men, NaCl, acid citric, HClđđ, acid acetic, c n, Na2CO3, NaOH, Vitamin C.
Ngu n g c t Merck: Thu c th folin, pepton. Ngu n g c t Anh: DPPH
Các hoá ch t s d ng đã đ t đ c đ tinh khi tphân tích.
2.4. D ng c vƠ thi t b s d ng
pH k
Máy l c chân không. Máy cô quay chân không. Máy đo UV-VIS.
Máy ly tâm. T m
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 26 T s y
Cân phân tích. B p đi n.
Erlen, bercher, ng nghi m, gi y l c, pipet, bóp cao su, … Và các d ng c thí nghi m thông th ng khác.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 27 3. PH NG PHÁP NGHIÊN C U 3.1. Quy trình trích ly Anthocyanin d ki n a) Quy trình Hình 2.1: S đ quy trình trích ly Anthocyanin Làm s ch, bóc v Trích ly L cthô u i dung môi Ch t màu Anthocyanin thô N c Dung môi N c th i, h tđ u Bã H t đ u đen Ch n l a nguyên li u Ly tâm
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 28 b) Thuy t minh quy trình
Ch n l a nguyên li u
M c đích: Quá trình ch n l a nguyên li u s tách ra các nguyên li u không đ t yêu c u đ m b o ch t l ng c a nguyên li u.
Quá trình phân lo i giúp chu n hoá nguyên li u, đ m b o nguyên li u đ t đ c đ đ ng nh t nh kích th c, hình d ng, màu s c, t tr ng,…
Cách th c hi n : Nguyên li u (đ u đen) sau khi mua v ti n hành tách, lo i b các h t có màu s c, kích th c không đ t, không sâu, không m t,…c ng nh lo i b các t p ch t có l n trong nguyên li u nh : s i, đá,…
Làm s ch, bóc v
M c đích: Lo i các t p ch t, ch t b n, các vi sinh v t b m t,…ra kh i nguyên li u đ u đen nh m nâng cao ch t l ng s n ph m cu i.
Ti n hành bóc v c a đ u đen đ chu n b cho quá trình trích ly.
Cách th c hi n: u đen sau khi đ c ch n l a thì ti n hành r a v i n c s ch 2-3 l n đ lo i b các ch t b n bám trên v đ u sau 5-7 phút th c hi n bóc v đ u đen. Tránh ngâm đ u đen trong n c đ tránh th t thoát hàm l ng ch t màu.
Trích ly
M c đích: Quá trình trích ly nh m khai thác các ch t màu Anthocyanin trong v h t đ u đen.
K t thúc quá trình trích ly, h n h p s đ c l c nh m thu d ch ch t màu. Cách th c hi n: V đ u đen thu đ c s đ c ngâm trong h dung môi đ đ trong đi u ki n kín ánh sáng đ trích ly ch t màu Anthocyanin.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 29
L c (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M c đích: Lo i b các t p ch t không tan và v đ u đen có trong d ch trích đ nâng cao ch t l ng s n ph m.
D ch trích sau khi l c qua thi t b l c chân không thì đem d ch trích đi ly tâm.
Cách th c hiên: Sau khi trích ly xong ti n hành l c l y d ch trích Anthocyanin b ng cách đ t t c d ch và v đ u đen vào ph u và ti n hành l c b ng thi t b l c chân không.
Ly tâm
M c đích: D ch trích sau khi l c thì đem đi ly tâm lo i b m t l n n a ph n c n có trong d ch trích. Sau đó đem d ch đi đu i dung môi.
Cách ti n hành: D ch trích sau khi đ c l c chân không ti n hành ly tâm đ tách b m t l n n a các ch t c n trong quá trình l c đã đ l i (ly tâm 3500 vòng/5phút).
u i dung môi
M c đích : Quá trình đu i dung môi nh m tách dung môi ra kh i s n ph m, do đó n ng đ ch t khô c a s n ph m t ng lên.
Cách th c hi n: D ch trích sau khi l c thì đ c đem đi cô quay chân không đ đu i dung môi.
Ch t màu Anthocyanin
Là ph n ch t b t còn l i sau khi cô quay đu i dung môi.
3.2. S đ nghiên c u
Tr c khi ti n hành các thí nghi m chính, chúng tôi ti n hành các thí nghi m s b đ ch n ra các kho ng dao đ ng bi n thiên đ b trí trong các thí nghi m
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 30 chính th c. Nghiên c u m t s y u t nh h ng đ n quá trình trích ly h p ch t Anthocyanin t h t đ u đen đ c th c hi n theo s đ :
Hình 2.2: S đ các giai đo n nghiên c u quy trình trích ly Anthocyanin
3.3. N i dung nghiên c u
3.3.1. Kh o sát b c sóng h p th c c đ i c a d ch trích Anthocyanin
M c đích thí nghi m: Trong quá trình kh o sát nhóm màu Anthocyanin c n rút ra nh ng đi u ki n trích lyt i u v th i gian, nhi t đ , dung môi,…làm sao đ t giá tr OD cao khi đo m t đ quang đ đ c hàm l ng Anthocyanin trong d ch trích cao nh t. Vì th vi c đ u tiên c n ph i xác đ nh b c sóng c c đ i c a d ch tríchAnthocyanin t đ u đen. Kh o sát kh n ng kháng khu n Kh o sát m t s y u t nh h ng đ n quá trình trích ly Nguyên li u Kh o sát th i gian trích ly Kh o sát nhi t đ trích ly Kh o sát nh h ng c a t l nguyên li u và dung môi Xác đ nh m t s đ c tính c a Anthocyanin thô Kh o sát kh n ng kháng oxy hoá Kh o sát b c sóng h p th c c đ i ánh giá ch t l ng s n ph m Anthocyanin thô Kh o sát nh h ng c a h dung môi
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 31
B trí thí nghi m
V đ u đen: 2,0g
Th i gian trích ly: 2 gi . Nhi t đ trích ly: 400C.
T l nguyên li u (g): dung môi (ml): 2/100 Dung môi: Dung d ch acid citric 0,5%
Ti n hƠnh thí nghi m
Nguyên li u mua v r a s ch,bóc v , cân.
Sau đó ngâm nguyên li u vào dung môi – dung d ch citric 0.5%. Gi h n h p nhi t đ 400
C trong 2 gi .
Thí nghi m đ c th c hi n theo hình 2.1 m c 3.1.
D ch màu thu đ c pha loãng 10 l n r i đem đi u ch nh pHv 1. Ti n hành đo đ h p th v i b c sóng trong vùng 470-570nm.
Thí nghi m đ c l p l i 3 l n. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
K t qu x lỦ th ng kê s li u b ng ph n m m Statgraphic plus 3.0.
Ch tiêu đánh giá: h p th c a d ch trích Anthocyanin.
3.3.2. Kh o sát các y u t nh h ng đ n quá trình trích ly Anthocyanin
a. Kh o sát nh h ng c a h dung môi đ n kh n ng trích ly Anthocyanin
Kh o sát s nh h ng c a dung d ch acid đ n quá trình trích ly
M c đích thí nghi m: Tìm lo i acid t i u cho quá trình trích ly.
B trí thí nghi m
V đ u: 3,0g.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 32 Nhi t đ trích ly: 400C.
T l nguyên li u: dung môi: 3g /100ml
Dung môi: Thí nghi m đ c ti n hành v i các h dung môi theo b ng:
B ng 2.1: B trí thí nghi m kh o sát nh h ng c a dung dch acid đ n trích ly N ng đ (%) M u N ng đ (%) M u N c 0 A1 Acetic 1 A6 HCl 0,5 A2 1,5 A7 1 A3 Citric 0,5 A8 1,5 A4 1 A9 Acetic 0,5 A5 0,5 A10 Ti n hƠnh thí nghi m
V đ u đ c ngâm vào các h dung môi nh trên. Gi h n h p nhi t đ 400 C trong kho ng 2 gi .
Thí nghi mđ c th c hi n theo hình 2.1 m c 3.1
D ch màu thu đ c pha loãng 10 l n r i đem đi u ch nh pH v 1 và 4,5. Ti n hành đo đ h p th v i b c sóng h p th c c đ i theo k t qu thí nghi m 3.3.1.
Thí nghi m đ c l p l i 3 l n.
Ch tiêu đánh giá: Hàm l ng Anthocyaninđ c tính theo ph l c 2. Ti n hành so sánh hàm l ng Anthocyanin gi a các nghi m th c. S li u sau khi thu đ c đem phân tích ph ng sai (ANOVA) và ki m tra s sai khác nh nh t
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 33 (Ducan) đ ch n nghi m th c cho hàm l ng Anthocyanin cao nh t và khác bi t m c Ủ ngh a 0,05.
Nh v y nghi m th c t i u là nghi m th c có hàm l ng Anthocyanin thu đ c cao nh t.
Kh o sát nh h ng c a n ng đ c n đ n quá trình trích ly
M c đích thí nghi m: Tìm ra n ng đ c nt i u cho quá trình trích ly.
B trí thí nghi m
V đ u: 3,0g.
Th i gian trích ly: 2 gi . Nhi t đ trích ly: 400
C.
T l nguyên li u: dung môi: 3g /100ml
Dung môi: theo thông s t i u thí nghi m kh o sát nh h ng c a dung d ch acid đ n quá trình trích lyv i các n ng đ c n b trí theo b ng.
B ng 2.2: B trí thí nghi m kh o sát nh h ng c a n ng đ c n đ n trích ly c n M u c n M u C n 00 B1 C n 500 B4 C n 300 B2 C n 600 B5 C n 400 B3 Ti n hƠnh thí nghi m
V đ u đen đ cngâm vào dung môic n v i các n ng đ nh trên, b sung thông s t i u thí nghi m kh o sát nh h ng c a dung d ch acid đ n quá trình trích ly. Gi h n h p nhi t đ 400 C trong kho ng 2 gi .
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 34 Thí nghi m đ c th c hi n theo hình 2.1 m c 3.1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D ch màu thu đ c pha loãng 10 l n r i đem đi u ch nh pH v 1 và 4,5. Ti n hành đo đ h p th v i b c sóng h p th c c đ i theo k t qu thí nghi m 3.3.1.
Thí nghi m đ c l p l i 3 l n.
Ch tiêu đánh giá: Hàm l ng Anthocyanin đ c tính theo ph l c 2. Ti n hành so sánh hàm l ng Anthocyanin gi a các nghi m th c. S li u sau khi thu đ c đem phân tích ph ng sai (ANOVA) và ki m tra s sai khác nh nh t (Ducan) đ ch n nghi m th c cho hàm l ng Anthocyanin cao nh t và khác bi t m c Ủ ngh a 0,05.
Nh v y nghi m th c t i u là nghi m th c có hàm l ng Anthocyanin thu đ c cao nh t.
b. Kh o sát nh h ng c a t l dung môi vƠ nguyên li u đ n kh n ng trích ly
Anthocyanin
M c đích thí nghi m: Tìm ra đ c t l dung môi và nguyên li u trích ly có kh n ng trích lycao nh t.
B trí thí nghi m
V đ u đen: 3,0g
Th i gian trích ly: 2 gi . Nhi t đ trích ly: 400C.
Dung môi: theo thông s t i u thí nghi m 3.3.2 a.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 35
B ng 2.3: B trí thí nghi m kh o sát t l dung môi (ml): nguyên li u (g) đ n trích ly
T l nguyên li u : dung môi (g/ml) M u
1:20 C1 1:30 C2 1:40 C3 1:50 C4 1:60 C5 1:70 C6 Ti n hƠnh thí nghi m
u đen sau khi mua v lo i b h t sâu b nh, cân, r a s ch, bóc v .
Cho m uv đ u đã đ c x lỦ vào h dung môi v i các t l khác nhau. Gi h n h p nhi t đ 400C trong th i gian là 2 gi .
Thí nghi m đ c th c hi n theo hình 2.1 m c 3.1.
D ch màu thu đ c pha loãng 10 l n r i đem đi u ch nh pH v 1 và 4,5. Ti n hành đo đ h p th v i b c sóng h p th c c đ i theo k t qu thí nghi m 3.3.1.
Thí nghi m đ c l p l i 3 l n.
Ch tiêu đánh giá: Hàm l ng Anthocyanin đ c tính theo ph l c 2. Ti n hành so sánh hàm l ng Anthocyanin gi a các nghi m th c. S li u sau khi thu đ c đem phân tích ph ng sai (ANOVA) và ki m tra s sai khác nh nh t (Ducan) đ ch n nghi m th c cho hàm l ng Anthocyanin cao nh t và khác bi t m c Ủ ngh a 0,05.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 36 Nh v y nghi m th c t i u là nghi m th c có hàm l ng Anthocyanin thu đ c cao nh t.
c. Kh o sát nh h ng c a nhi t đ đ n kh n ng trích ly Anthocyanin
M c đích thí nghi m: kh o sát nh h ng c a nhi t đ đ n hàm l ng Anthocyanin thu đ c, t đó tìm ra đ c nhi t đ có kh n ng trích lycao nh t.
B trí thí nghi m
V h t đ u đen: 3,0g. Th i gian trích ly: 2gi .
Dung môi: theo thông s t i u thí nghi m 3.3.2 a.
T l nguyên li u: dung môi: thông s t i u thí nghi m 3.3.2 b. Nhi t đ trích ly đ c b trí nh b ng sau: B ng 2.4: B trí thí nghi m kh o sát nh h ng c a nhi t đ đ n trích ly Nhi t đ (oC) M u 300C (nhi t đ phòng) D1 400C D2 500C D3 600C D4 700C D5 Ti n hƠnh thí nghi m
Cho m u v đ u đã đ c x lỦ vào h dung môi v i các t l dung môi và nguyên li u đã ch n thí nghiêm 3.3.2a và 3.3.2b. Trong th i gian là 2 gi . Nhi t đ thay đ i nh trên.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 37 D ch màu thu đ c pha loãng 10 l n r i đem đi u ch nh pH v 1 và 4,5. Ti n hành đo đ h p th v i b c sóng h p th c c đ i theo k t qu thí nghi m 3.3.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghi m đ c l p l i 3 l n.
Ch tiêu đánh giá: Hàm l ng Anthocyanin đ c tính theo ph l c 2. Ti n hành so sánh hàm l ng Anthocyanin gi a các nghi m th c. S li u sau khi thu đ c đem phân tích ph ng sai (ANOVA) và ki m tra s sai khác nh nh t (Ducan) đ ch n nghi m th c cho hàm l ng Anthocyanin cao nh t và khác bi t m c Ủ ngh a 0,05.
Nh v y nghi m th c t i u là nghi m th c có hàm l ng Anthocyanin thu đ c cao nh t.
d. Kh o sát nh h ng c a th i gian đ n kh n ng trích ly Anthocyanin
M c đích thí nghi m: kh o sát nh h ng c a th i gian đ n hàm l ng c a Anthocyanin thu đ c, t đó tìm ra đ c th i gian thích h p nh t chotrích ly.
B trí thí nghi m
V h t đ u đen: 3,0g.
Dung môi: theo thông s t i u thí nghi m 3.3.2 a.
T l nguyên li u: dung môi: thông s t i u thí nghi m 3.3.2 b. Nhi t đ trích ly: thông s t i u thí nghi m 3.3.2 c.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 38 B ng 2.5: B trí thí nghi m kh o sát nh h ng c a th i gian đ n trích ly Th i gian (gi ) M u 1 E1 2 E2 3 E3 4 E4 5 E5 Ti n hƠnh thí nghi m
Cho m u v đ u đã đ c x lỦ vào h dung môi v i các t l dung môi :nguyên li u và nhi t đ đã ch n thí nghiêm 3.3.2a, 3.3.2b, 3.3.2c trong th i gian nh b trí trên.
Thí nghi m đ c th c hi n theo hình 2.1 m c 3.1
D ch màu thu đ c pha loãng 10 l n r i đem đi u ch nh pH v 1 và 4,5. Ti n hành đo đ h p th v i b c sóng h p th c c đ i theo k t qu thí nghi m 3.3.1.
Thí nghi m đ c l pl i 3 l n.
Ch tiêu đánh giá: Hàm l ng Anthocyanin đ c tính theo ph l c 2. Ti n hành so sánh hàm l ng Anthocyanin gi a các nghi m th c. S li u sau khi thu đ c đem phân tích ph ng sai (ANOVA) và ki m tra s sai khác nh nh t (Ducan) đ ch n nghi m th c cho hàm l ng Anthocyanin cao nh t và khác bi t m c Ủ ngh a 0,05.
Nh v y nghi m th c t i u là nghi m th c có hàm l ng Anthocyanin thu đ c cao nh t.
[SVTH: Nguy n Th Kim Ngân-1053010478] Page 39 3.3.3. Kh o sát ho t tính sinh h c a. Kh o sátkh n ng kháng oxy hoá M c đích: kh o sát kh n ng kháng oxy hoá c a m u s n ph m