III.1: Kết quả nghiên cứu về nguyên liệu:
Kết quả nghiên cứu thành phần chính của nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.1: Kết quả thành phần hóa học của đầu tôm nguyên liệu
Võ Thị Duyên – CNTP3 – K50 26
STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả
1 Độ ẩm (%) 77,80
2 Hàm lượng tro tổng số (%) 23,26
Bảng 3.2: Kết quả tham khảo thành phần hóa học của đầu tôm nguyên liệu
Như vậy: kết quả nghiên cứu tho thấy độ ẩm và thành phần khoáng tương đối gần nhau. Hàm lượng protein của tôm nguyên liệu cao hơn so với kết quả tham khảo (51,42 >47,4 ± 1,8). Điều này được giải thích như sau:
• Do kĩ thuật bóc vỏ nên trên đầu tôm còn sót lại thịt tôm
• Do trong phế liệu tôm còn có những con tôm bị ươn, hỏng không được sử dụng để chế biến thực phẩm
• Do tỷ lệ giữa các thành phần trong vỏ tôm không ổn định, chúng thay đổi theo mùa vụ, theo giống, theo giống, loài và đặc điểm sinh thái, sinh lý
III.2: Kết quả nghiên cứu quá trình sản xuất chitin:
III.2.1. Giai đoạn khử protein lần 1:
Chitin là một polysaccarit cao phân tử, trong vỏ tôm nó liên kếtvới protein bằng liên kết cộng hóa trị mạnh (Brine, 1991; Roberts, 1992 ; Chang, 1997) . Quá trình khử protein trong vỏ tôm thực chất là quá trình thủy phân protein. Trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình này diễn ra dưới tác dụng của NaOH. Nghiên cứu của Percot và cộng sự (2003) đã chỉ rõ khi khử protein chỉ bằng NaOH năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu khá lớn vì vậy cần sử dụng NaOH có nồng độ cao, trong thời gian dài, dẫn đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng của protein tách ra.
Võ Thị Duyên – CNTP3 – K50 27
STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả
1 Độ ẩm (%) 77,5 ± 1,2
2 Hàm lượng tro tổng số (%) 24,6 ± 0,8 3 Hàm lượng protein (%) 47,4 ± 1,8
Trong nghiên cứu này, em sử dụng Enzym alcalaza là một proteza kiềm. Alcalaza sẽ xúc xúc tác cho phản ứng phân cắt các liên kết peptit trong phân tử protein tạo thành các axit amin hòa tan trong nước và các axit amin này sẽ được tách ra khỏi vỏ tôm trong quá trình rửa trung tính sau thủy phân. Do đó mà làm giảm lượng protein trong vỏ tôm. Bên cạnh đó có thể tận dụng dịch thủy phân protein làm thức ăn cho gia súc.
III.2.1.1: Lựa chọn các yếu tố và miền khảo sát:
Căn cứ vào đặc tính của enzym alcalaza, lựa chọn miền khảo sát như sau: - Nhiệt độ thủy phân : từ 50 – 65 0C.
- pH của dịch thủy phân: từ 8 – 9. - Thời gian thủy phân: từ 90 – 240 phút. - Lượng enzym thủy phân: từ 1 – 2 ml.
Bảng 3.3: Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố khảo sát
Yếu tố Ký hiệu Đơn vị Mức - α -1 0 +1 +α pH A 7,79289 8 8,5 9 9,20711 Nhiệt độ B 0C 46,8934 50 57,5 65 68,1066 Lượng enzym C ml 0,792893 1 1,5 2 2,20711 Thời gian D phút 58,934 90 165 240 271,066
III.2.1.2. Thiết lập mô hình
Kết quả thực nghiệm khử protein theo quy hoạch trực giao bậc hai, bốn yếu tố được liệt kê trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein còn lại
Std A: pH B: nhiệt độ (0C) C: lượng Enzym (ml) D: thời gian (phút) Hàm lượng Protein còn lại (% chất khô) 1 8.00 50.00 1.00 90.00 21.28 Võ Thị Duyên – CNTP3 – K50 28
8 9.00 50.00 1.00 90.00 16.863 8.00 65.00 1.00 90.00 15.29 3 8.00 65.00 1.00 90.00 15.29 4 9.00 65.00 1.00 90.00 17.98 5 8.00 50.00 2.00 90.00 17.78 6 9.00 50.00 2.00 90.00 13.70 7 8.00 65.00 2.00 90.00 16.12 8 9.00 65.00 2.00 90.00 16.39 9 8.00 50.00 1.00 240.00 20.48 10 9.00 50.00 1.00 240.00 17.29 11 8.00 65.00 1.00 240.00 14.62 12 9.00 65.00 1.00 240.00 18.60 13 8.00 50.00 2.00 240.00 14.54 14 9.00 50.00 2.00 240.00 11.85 15 8.00 65.00 2.00 240.00 13.10 16 9.00 65.00 2.00 240.00 14.70 17 8.50 57.50 1.50 165.00 14.00 18 8.50 57.50 1.50 165.00 13.22 19 8.50 57.50 1.50 165.00 13.34
Khả năng khử protein được đánh giá bằng hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân và rửa trung tính. Hàm lượng protein còn lại càng thấp, khả năng khử càng cao.
Lần lượt xét ảnh hưởng của từng yếu tố (khi giữ nguyên các yếu tố khác ở những giá trị xác định).
III.2.1.2.a.Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử protein được thể hiện ở hình 3.3:
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH thủy phân đến hiệu quả của quá trình khử protein
Dựa vào bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 50 – 60 0C. Nếu tăng nhiệt độ lên cao, ví dụ 65 0C sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme alcalaza vì độ bền và hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào độ bền nhiệt của protein enzyme, enzyme sẽ giảm dần hoạt tính, và nếu tăng quá cao, enzym sẽ bị vô hoạt. Cụ thể khi so sánh thí nghiệm số 14 và 16 ta thấy: ở cùng điều kiện pH = 9, thời gian thủy phân là 240 phút , hàm lượng enzym cho vào là 2 ml thì hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân ở 65 0C là 14,7 %, trong khi ở nhiệt độ 50 0C là 11,85 %.
III.2.1.2.b.Ảnh hưởng của pH dung dịch thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng
của pH đến khả năng khử protein được thể hiện ở hình 3.4:
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH dung dịch thủy phân và lượng enzym tới quá trình khử protein
Hình 3.4 và bảng 3.3 cho thấy alcalaza là một proteaza kiềm. Và pH thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 8,5 – 9. Ở cùng điều kiện nhiệt độ 50 0C, thời gian 240 phút, lượng enzym là 1 ml, khi pH tăng thì khả năng khử protein tăng thể hiện ở thí nghiệm số 9 và số 10, khi pH = 8 hàm lượng protein còn lại là 20,48% nhưng khi tăng pH lên 9 thì hàm lượng protein giảm còn 17,29%.
III.2.1.2.c. Ảnh hưởng của lượng enzym tới quá trình khử protein:
Ảnh hưởng của lượng enzym tới quá trình thủy phân protein được thể hiện trên hình 3.5:
Hình 3.5: Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ và lượng enzym đến hiệu quả của quá trình khử protein.
Bảng 3.3 và hình 3.5 cho thấy khi nồng độ enzym càng tăng thì hiệu quả khử protein càng tăng. Qua nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy rằng quá trình tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm giải phóng ra enzym tự do thường trải qua 3 giai đoạn như ở sơ đồ dưới đây [10]:
E + S ES P + E
−Giai đoạn thứ nhất: enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hởi năng lượng hoạt hóa thấp.
−Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
−Giai đoạn thứ ba: tạo ra sản phẩm còn enzym được giải phóng ra dưới dạng tự do. Như vậy, với ưu điểm tạo ra enzym ở dạng tự do ở giai đoạn thứ ba sẽ quay vòng trở lại tiếp tục tham gia phản ứng thủy phân. Hơn nữa, cùng với lượng cơ chất không đổi khi hàm lượng enzym tăng sẽ tăng cường xúc tác cho phản ưng thủy phân đạt hiệu quả
cao hơn. Tuy nhiên, nếu lượng enzym cho vào quá cao sẽ gây lãng phí. Và cần lưu ý rằng, nếu phản ứng ở nhiệt độ cao và thời gian dài thì sẽ làm giảm hoạt lực của enzym, làm giảm khả năng xúc tác của enzym.
Cụ thể khi so sánh kết quả thí nghiệm số 2 và số 6: ở cùng điều kiện nhiệt độ 50 0C, pH = 9.0 , thời gian thủy phân là 90 phút, khi lượng enzym là 1 ml thì hàm lượng protein còn lại là 16,86 % nhưng khi tăng hàm lượng enzym lên 2 ml thì hàm lượng protein còn lại giảm đáng kể chỉ còn 13,7 %. Như vậy hàm lượng protein còn lại giảm 18,74 %.
III.2.1.2.d.Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein.
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein được thể hiện trong hình 3.6.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian và lượng enzym đến quá trình khử protein
Bảng 3.3 và hình 3.6 cho thấy, thời gian thủy phân càng lâu thì hiệu quả thủy phân càng tốt, hàm lượng protein còn lại càng thấp. Điều này được giải thích như sau: ban đầu, enzyme tiếp xúc với protein ở lớp ngoài của vỏ tôm, sau khi thủy phân protein ở lớp ngoài, các liên kết peptit bị cắt đứt, tạo các axit amin hòa tan vào dung dịch phản ứng do đó tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với các phân tử protein ở lớp trong của vỏ
tôm. Cứ thế, quá trình phản ứng tiếp tục diễn ra. Vì vậy, thời gian thủy phân càng kéo dài thì khả năng thủy phân protein càng tăng. So sánh kết quả thí nghiệm số 8 và 14: ở cùng điều kiện thủy phân 50 0C, pH = 9, và lượng enzyme là 2 ml, khi thời gian thủy phân là 90 phút thì hàm lượng protein còn lại là 13,7 %. Khi tăng thời gian thủy phân lên 240 phút thì hàm lượng protein còn lại là 11,85 %. Như vậy, hàm lượng protein còn lại giảm 13,50 %.
Mặt khác, trong quá trình thủy phân các liên kết giữa chitin-protein-xianin (astaxanthin liên kết với lipoprotein)-lipit cũng bị khử nên astaxanthin bị tách ra trong hỗn hợp phản ứng dưới dạng màu nâu đỏ, lipit tách ra khuyech tán vào dung dịch. Thời gian thủy phân càng dài, lượng protein bị thủy phân càng lớn, astaxanthin, lipit tách ra càng nhiều, hiệu quả khử màu, khử lipit càng cao.
III.2.1.3. Tối ưu hóa quá trình khử protein:
Quá trình khử protein được tiến hành sao cho hàm lượng protein còn lại trong vỏ tôm sau thủy phân là nhỏ nhất. Tiến hành giải bài toán tối ưu hóa theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.6 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của bộ 4 yếu tố ảnh hưởng mà tại đó ta thu được hàm lượng protein thấp nhất.
Tiến hành xây dựng hàm hồi quy bậc 2 cho mục tiêu hàm lượng protein còn lại (nhỏ nhất).
Hàm lượng protein còn lại: R1 = a0 + a1 A +a2B + a3C + a4D + a12AB + a13AC + a14AD + a23BC + a24BD + a34CD + a11A2 + a22B2 + a33C2 + a44D2
Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số và sự tương thích của mô hình được tiến hành bằng phân tích hồi quy theo phụ lục 4:
- Chuẩn F của mô hình bằng: 32.90 cho thấy hai mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99.99% (p<0.0001).
- Hệ số tương quan bội của mô hình là R2 = 0.9705 và Adj R2 = 0,9410 cho thấy mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm.
- Kết quả kiểm tra sự không có nghĩa của mô hình là “not significant” cũng cho thấy mô hình hoàn toàn có nghĩa.
Theo phụ lục 5 ta có:
Hàm mục tiêu hàm lượng protein còn lại dạng code là:
Ham luong protein = +16.29 -0.37 * A -0.44 * B -1.51 * C -0.64 * D +1.43 * A * B -0.25 * A * C +0.74* B * C
-0.59 * C * D -2.77
Hàm mục tiêu hàm lượng protein còn lại dạng thực là: R1 = +219.04183-21.21000 * pH- 3.60167 * Nhiet do-3.39883 * Luong enzim+0.014933 * thoi gian +0.38200 * pH * Nhiet do-0.99000 * pH * Luong enzim+0.19767* Nhiet do * Luong enzim-0.015633 * Luong enzim * Thoi gian
Tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của bộ 4 yếu tố ảnh hưởng mà tại đó ta thu được hàm lượng protein thấp nhất với mục tiêu theo bảng sau:
Bảng 3.5: Mục tiêu hàm lượng protein theo yêu cầu
Yếu tố Mục tiêu Giới hạn
dưới Giới hạn trên Tầm quan trọng pH Trong giải 8 9 3
Nhiệt độ (0C) Trong giải 50 65 5
Lượng enzym Trong giải 1 2 5
Thời gian 165 90 240 3
Hàm lượng protein Thấp nhất 5
Kết quả thu được ở phụ lục 1.
Dựa vào phụ lục 1 cho kết quả tối ưu của quá trình khử protein lần 1 bằng enzym là:
Bảng 3.6: Điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein từ phế liệu tôm
Yếu tố Tối ưu
Nhiệt độ 50 0C
pH 9
Thời gian 165 phút
Lượng enzym 2 ml
Khi đó các mức độ đáp ứng hàm mong đợi được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7 thể hiện các yếu tố pH, nhiệt độ, lượng enzym, thời gian đạt được tối ưu thì khả năng đạt được hàm mong đợi (hàm lượng protein còn lại thấp nhất) là rất cao đạt tới 93,929 %.
Tiến hành thực nghiệm theo điều kiện tối ưu. Kết quả thành phần hoá học của vỏ tôm được thể hiện ở bảng 3.7:
Bảng 3.7: Thành phần hoá học của vỏ tôm
Thành phần
Hàm lượng(%)
Mẫu nguyên liệu Mẫu sau khi khử
protein
Protein 51,42 12,42
Tro 23,26
Như vậy, so với các phương pháp hóa học (sử dụng kiềm để khử protein) thì quá trình khử protein bằng enzym mang lại nhiều ưu điểm: giảm được chi phí sản xuất do tận dụng được dịch thủy phân protein làm thức ăn cho chăn nuôi gia súc do vậy không tạo ra nguồn nước thải có hại cho môi trường. Quá trình thủy phân ở nhiệt độ 50 0C trong thời gian 165 phút sẽ giảm chi phí năng lượng hơn so với quy trình thủy nhiệt Yamasaky và Nacamichi Nhật Bản ở nhiệt độ 1500C [7] và quy trình của xí nghiệp thuỷ sản Hà nội [8] ở nhiệt độ 90-950C. (đều khử protein bằng phương pháp hóa học)
So với kết quả nghiên cứu của Helenike Duarte Holanda and Flavia Maria Netto [9] (Hàm lượng protein còn lại sau khi khử protein bằng enzym alcalaza là 9,19 ±0,1 %). Sở dĩ có sự khác nhau đó là do trong nghiên cứu của Helenike Duarte Holanda and Flavia Maria Netto thủy phân trong điều kiện: hàm lượng enzym alcalaza là 3%, nhiệt độ 60 0C, thời gian 240 phút).
Đánh giá cảm quan quá trình khử proteinlần 1:
Hình 3.8.a: vỏ tôm nguyên liệu Hình 3.8.b : vỏ tôm sau khi khử Protein
Hình 3.8.a, b, c cho thấy:
- Màu sắc: vỏ tôm sau khi thủy phân đã mất một lượng nhỏ những vết màu đỏ như ở vỏ tôm nguyên liệu, chứng tỏ trong quá trình thủy phân protein, astaxanthin cũng bị khử nhưng không đáng kể. Mẫu khử bằng enzym cho màu sắc sẫm màu trong khi quá trình khử bằng NaOH cho chitin màu trắng.
Như vậy, quá trình khử protein bằng enzym chúng ta có thể tận thu được chất màu astaxanthin có tính chất chống oxi hóa
- Bề mặt: Vỏ tôm sau khi thủy phân protein có bề mặt không bóng bằng vỏ tôm nguyên liệu do trong quá trình khử protein, lipid cũng bị khử theo, làm giảm hàm lượng lipid trong vỏ tôm, dẫn đến thay đổi sự khúc xạ ánh sáng trên bề mặt vỏ tôm.
- Độ cứng: Vỏ tôm sau thủy phân mềm hơn vỏ tôm nguyên liệu do một phần các muối khoáng trong thành phần của vỏ tôm cũng bị khử trong quá trình thủy phân protein.
III.2.2. Giai đoạn khử protein lần 2:
Để đáp ứng yêu cầu chỉ tiêu chất lượng của chitin (hàm lượng tro < 5%, hàm lượng protein < 5%) cần thiết phải tiến hành quá trình khử protein lần 2.
Tiến hành khử protein lần 2 theo 2 hướng: − Khử protein bằng enzym alcalaza. − Khử protein bằng NaOH 1%.
Bảng 3.8: Hàm lượng protein còn lại sau khử protein lần 2 bằng enzym
Hàm lượng Pr ban đầu (%) Tỷ lệ enzym/mẫu (v/w Tỷ lệ vỏ tôm/nước Thời gian (phút) pH Nhiệt độ (0C) Hàm lượng Pr còn lại (%) 12,42 1 1/10 165 9 50 3,3
Bảng 3.9: Hàm lượng protein còn lại sau khử protein lần 2 bằng NaOH
Như trên đã nói thì trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình khử